辽宁省锦州市首例输入性登革热病例的调查、快速检测方法与防控探讨
[摘要] 目的 通過调查总结输入性登革热的防治经验，并建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革热病毒，更好地指导今后登革热防制工作。 方法 流行病学调查，利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3’端非编码区一段序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和探针，以DF病毒株作为标准，以乙脑毒株作阴性对照，建立荧光PCR检测DF的快速方法。同时给予1份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行荧光PCR扩增。 结果 采用PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，与设计相符；而乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，1份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83.3%（25/30），其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14/97、GD05/99同源性分别为97%。 结论 在今后的登革热防控工作中，我们应用RT-PCR检测方法时间短、灵敏性高、有较高的特异性，以此作为为DF的临床早期诊断方法；其次重点加强出国和归国人员的管理，开展登革热防治知识的宣传教育，建立和其他部门的登革热联防体制，加强基层医务人员登革热防治知识培训，提高基层医务人员登革热诊治水平，来达到控制登革热的目标。
[关键词] 输入性；登革热；监测；RT-PCR
[中图分类号] R512.8 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）09-0079-05
Survey， rapid detection method， prevention and control of first imported dengue fever of Jinzhou City in Liaoning Province
LI Zhijun1 FAN Kai2 SONG Ying2 LUO Mei3
1.Linghai Disease Control and Prevention Center in Liaoning Province， Linghai 121200， China； 2.Jinzhou Disease Control and Prevention Center in Liaoning Province， Jinzhou 121000， China； 3.Institute of Life Sciences， Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China
[Abstract] Objective To summarize the experience of prevention and treatment of imported dengue fever by investigation and to establish Taqman MGB real-time fluorescence PCR to detect dengue virus rapidly so as to better guide dengue fever prevention and control work in the future. Methods The epidemiological investigation was carried out in the field. According to a highly conserved sequence of the non-coding region of dengue virus 3 "end， dengue 1.4 fluorescent PCR universal primer and Taqman MGB probe were designed， using Taqman MGB technique. The rapid detection method of real-time fluorescence PCR detection of dengue virus was established， with Dengue fever virus strain as the standard and JE as the control. The clinical serum sample of the one case of ELISA test positive were amplified by RT-PCR and fluorescent PCR amplification. Results The dengue virus type 1 to 4 were amplified using PCR primers， which was consistent with the design. However， there was no non-specific amplification band for Japanese encephalitis virus. The primer correlation experimental results showed that the false positive results would not occur due to mutual interference between the primers. The positive rate of RT-PCR amplification in one suspected patient"s blood sample was 83.3% （25/30）. Its nucleotide sequence homology with dengue virus type 1 Cambodia， China GD14/97， GD05/99 in 1997 and 1999 was 97%. Conclusion In the prevention and control of dengue fever in the future， RT-PCR is a rapid， sensitive and specific method， which can be used as an early clinical diagnostic method for dengue fever. Second， we will focus on strengthening the management of overseas personnel and returnees， develop the publicity and education of dengue fever prevention and treatment. We also establish the defense system of dengue fever with other departments， strengthen the training on dengue fever prevention and control among grassroots medical workers and improve the level of diagnosis and treatment of dengue fever among grassroots medical workers so as to achieve the goal of controlling dengue fever.
[Key words] Input；Dengue fever；Monitoring；RT-PCR
登革热和登革出血热是一种急性传染病，是热带、亚热带地区的严重公共卫生问题，由登革热病毒经蚊媒传播[1]。据有关权威部门的数据统计，全球每年约有7千万到1亿人感染DF病毒，每年24 000人死亡[2]。锦州市属于登革热非流行区从20世纪50年代初有疫情记载以来，无登革热病本地感染病例。锦州市疾控中心于2015年2月15日对一例输入性登革热病例进行调查处理，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 个案调查
根据《登革热流行病学个案调查表》进行病例调查，查看病例资料。诊断标准参照《登革热诊断标准及处理原则》（WS 216-2008）[3]。
1.2 实验室检查及病原学检查
检测血、尿和粪便常规及血清生化项目等；由锦州医科大学附属第一医院检验科采用荧光PCR法对采集的病例急性期血清标本进行病原学检测。
1.2.1 材料 乙脑病毒疫苗株由上海生物制品所提供。阳性血清标本采自于锦州市近期发病1周内的登革热患者和发病10 d内的乙型脑炎患者，-86℃保存。所有阳性临床血清标本根据实验室IgM、IgG检测为阳性进行确诊。DV1～4型基因组RNA由广东省疾病预防控制中心提供，TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 Marker、DNA 连接酶、DNA质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、pMD18-T载体等购于大连TaKaRa公司，其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2.2 RNA提取 1～4型DF病毒标准株采用1640培养基进行溶解，接种C6/36细胞，20℃～33℃进行培养、传代，按病毒提取RNA试剂盒说明书进行提取，同时-86℃保存备用。
1.2.3 反转录与 PCR扩增 RNA反转录 反应总体积为40 μL，在反应管内依次加入：10×缓冲液 10 μL，510 mmol/L 8×dNTP 2 μL，0.3 U/μL Random（金斯瑞公司生产）引物1 μL，RNA 12 μL，AMV Reverse Transcriptase（10 μL）1 μL混匀。反应条件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。产物放置于-20℃备用。
PCR扩增：反应总体积为20 μL，在反应管内依次加入：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture（10 mM） 1 μL，通用引物D1、D2（5 μmol/L）各1 μL，cDNA 0.5 μL（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型）、2 μL（Ⅲ型、血清标本、阴性对照），ExTaq酶（5 U/μL）0.25 μL加H2O补足体系。
1.2.4 实时荧光PCR 需反应的总体积为40 μL，在管内依次加入：20×缓冲液4 μL，10 mmol/L MgCl2 2.5 μL，引物DenFP、DF-RP（10 μmol/L）各0.5 μL（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型），2 μL（Ⅲ型，血清标本，阴性对照）Taq酶（5 U/μL）0.25 μL加H2O补足体系。反应条件：50℃ 2 min，95℃10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，进行40个循环，4℃保存。采用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增，Tm值由扩增片段的长度决定，延伸阶段检测荧光。
1.2.5 疑似DF患者血清标本PCR扩增 选择锦州凌海市疾控中心1例疑似DF患者发病早期的血清标本进行多重PCR扩增。
1.2.6 基因克隆、鉴定和测序 扩增阳性PCR产物按照上海金斯瑞生物技术有限公司的DNA凝胶回收试剂盒说明书进行实验，回收产物连接至pMD18-T载体并转化JM109宿主菌，将摇好的菌液经DNA质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，PCR及酶切鉴定后，送至大连宝生物公司测序。
1.3 PCR检测的特异性试验
以DV1～4型病毒为阳性对照，不加DNA模板组、流行性乙型脑炎病毒均为阴性对照，应用同样方法进行扩增，验证多重PCR的特异性。
1.3.1 PCR检测敏感试验 取DV1～4型细胞培养液进行1∶10稀释，稀释后分别取300 μL进行核酸提取，按上述方法进行RT-PCR，取5 μL RT-PCR产物作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。验证RT-PCR的敏感性，同时DV1～4型特异性引物进行单引物扩增，以对比单引物和多引物敏感性的差异，见图1。
M 1 2 3 4 5 6
M：分子量标准DL2000；1：陰性对照；2流行性乙型脑炎病毒；3：DV 4 型；4：DV 3 型；5：DV 2 型；6：DV 1 型
1.3.2 PCR检测DV的敏感性 灵敏度：以DEN-1（图2A）为例，1×103 copies/mL浓度核酸可见扩增曲线，1×102 copies/mL未见明显扩增曲线，故 DEN-1检测限为1×103 copies/mL，DEN-2 为1×102 copies/mL（图2B），DEN-3为1×102 copies/mL（图2C），DEN-4为1×102 copies/mL（图2D）。
1.3.3 临床疑似DF患者批标本检测结果 RT-PCR扩增1份早期患者血标本，阳性率为83.3%（图3）。2株阳性率为83.3%。2株阳性标本经克隆测序后，与DV1型柬埔寨株以及我国1997、1999年DV1型流行株同源性分别为97%、97%、98%，进一步证实为DV1（图3）。
2 结果
2.1流行病学史
患者安某，纳米比亚籍，女，27岁，辽宁锦州某大学本科留学生。自述2015年1月17日去马来西亚旅游，2月12日经广州白云机场转机回辽宁锦州，在广州机场经入境检验，确诊登革热病毒核酸阳性，但患者拒绝在广州治疗，于当晚16时返回锦州学校。
2.2 临床症状和诊疗情况
该患者于2月15日13时由同学陪同来锦州市疾控中心，询问是否有登革热治疗的特效药物。询问得知其在12日发热，最高体温38.9℃，伴头痛、肌肉痛，无其他症状。患病期间自行服退热药物，13日晚上19点到某医学院附属第一院就诊，接诊医生初步问诊验血后，送检检验科应用Taqman MGB实时荧光PCR检测，诊断登革热临床病例但没有及时上报。
2.3实验室检查临床检验结果
血白细胞计数2.49×109/L，中性粒细胞百分数75.5%，血小板计数76×109/L，异性淋巴细胞（-）；尿潜血（-），尿蛋白质（-），尿白细胞（-），白蛋白28 g/L。
2.4 调查处置情况
病例在马来西亚旅游期间有蚊虫叮咬史，否认4周内有传染病患者接触史，否认两周内有家禽鸟类密切接触史，自述在广州机场经出入境部门确诊登革热，但无任何书面资料。2月15日采集患者血液标本，于2月16日上送省疾控中心进一步检验，在等待结果期间，我中心2月17日上午10时接到市卫计委转发的广东出入境检验检疫局《关于从2月12日入境人员中检出一例输入性登革热病例的情况通报》，市疾控中心17日11时通过中国疾病预防控制信息系统对该病例进行网络直报，并同时将该情况上报省疾控中心。18日辽宁省疾控中心检测结果为急性期血清登革热病毒核酸阳性。
2.5诊断依据根据《登革热诊断标准及处理原则》（WS216-2008）[3]
该病例有明确流行病学史，结合临床表现、实验室检查及病原学检测结果，确诊为输入性登革热实验室病例。
2.6 防治措施和效果评价
疾控中心建议病例到市传染病医院进行诊治，但患者因身体已无不适表现，拒绝入院治疗，疾控人员对该患者进行登革热防治知识的健康宣教，告知登革热无特效药物，对症治疗为主，叮嘱其控制体温，多喝水、休息，如病情变化到医院作进一步治疗。建立联防机制，明确学校责任人和联系方式，指导该所大学开展登革热防制工作，经15 d医学观察，该患者的密切接触人员无二代病例发生，患者痊愈。二月份我地区处于冬季，外环境无蚊虫活动，故没有开展蚊媒监测和消杀工作。
3 讨论
登革热的临床诊断经历了多种方法，目前逆转录式PCR 方法已经应用DF与黄病毒属的其他成员的鉴别以及DF的类型鉴别[4-5]。除了在病毒基因组中选择的特异性区域位置以及产物大小有所不同外，逆转录一套式PCR鉴定登革热病毒的型别所采用的原理基本一致，这方面已多有报道[6-10]使用一对通用引物，扩增DV1～4型病毒的3末端非编码区的核酸序列结果表明，该引物可以将登革病毒和同属于黄病毒科的其他病毒区分，如日本脑炎病毒、黄热病病毒等[11-13]。
我国东北地区以往发生登革热病例情况很少见。根据本例输入性登革热病例的调查和处理，提示我们在今后的登革热防制工作中重点做好如下工作[14]：
首先，要加强对去登革热高发地区出国人员的管理，加强登革热防治知识的宣传教育，提高自我保护意识，归国后应先到到疾病控制部门建立健康档案，一旦出现相关症状要及时到医院就诊，以早发现、早诊断、早治疗，防止输入性DF的扩散[15-16]。近几年来随着对外经贸关系的发展，锦州市赴东南亚等国家和地区务工、旅游、学习的人员越来越多，登革热输入病例风险有增加趋势。我国登革热的防控现阶段主要是依靠防止传染源的传入、控制蚊媒的办法来预防和控制登革热的传播[17]。
其次，该病例疾控中心能及时开展流行病调查，查清相关信息，规范处理控制疫情，无二代病例出现得益于疫情联防联控机制充分有效的落实。该病例首诊医生未能规范上报疫情[18]，提示在今后输入性传染病防控方面，加强基层医务工作者对DF知识培训，提高DF疫情报告意识；有关部门对卫生检疫、商务、外事有关部门的联系，及时掌握外派人员特别是到疫情高发地区人员的相关信息，回国后健康状况出现变化时疾控部门能及时调查和处理[19-20]。
最后，锦州历史蚊媒监测数据显示无伊蚊媒介，该输入病例提示我们在今后的监测工作中要关注登革热传播媒介伊蚊的监测，落实防蚊灭蚊措施，即可阻断登革热传播，杜绝二代病例的发生[5]。
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（收稿日期：2017-12-09）