内生真菌在中药现代化中的作用
[摘要]中药现代化是中药走出国门、为国际所认可和接受的必要基础，是振兴传统中药产业的必经之路。在中药现代化进程中存在着各种挑战；重金属超标、有效成分含量低创新性弱、中药资源利用与保护间的矛盾等。如何应用生命科学的新理论新技术来解决这些问题已成为当务之急。近年研究发现，内生真菌在药用植物生长发育等过程中发挥着不可替代的积极作用，对中药材生产的质和量影响较大。故该文对内生真菌在揭示药用植物道地性、中药材栽培种植、资源保护和开发利用等方面的作用进行阐述，探讨其在中药现代化中的应用前景，以期为促进中药现代化的发展提供新思路、新动力。
[关键词]内生真菌；中药现代化；作用
中药现代化是在继承与发扬传统中药优势和特色的基础上，严格遵循国际认可的标准规范，充分利用现代科学技术对中药进行研究、开发、生产、管理，最终研制出以“高品质”、“高技术”、“高国际化”为显著特征的现代中药，使中药产业成为具有强大国际竞争力的现代产业的过程。从1996年，我国正式提出中药现代化的口号至今，中药产业取得了长足的进步，但同时也面临着各种挑战。重金属含量超标、有效成分含量低、创新性弱、中药资源利用与保护间的矛盾等始终困扰着中药现代化的发展。如何应用现代生命科学的新理论新技术解决这些问题成为当务之急。
内生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。它们遍布于各种植物组织中，并为植物带来多种益处，如提高抗病虫害、抗盐渍、抗旱能力，促进植物的生长、分蘖，促进植物对氮、磷的吸收利用等，是现代生命科学的一大研究热点，而中药资源80%来源于药用植物，这意味着，内生真菌在中药领域同样有着不可忽视的积极作用。鉴此，本文将从道地药材形成机制、中药材生产及资源开发保护等方面，由理论到实践，由基础到应用，较全面地阐述内生真菌在中药现代化中的作用，以期为促进中药现代化的发展提供新思路、新动力。
1内生真菌在揭示道地药材形成机制方面的作用
道地药材是特定自然生态环境的地域内所产的名优正品药材，是中药材的精粹所在。长期以来，为了能给中药材生产提供更多的理论指导，人们在探索道地药材形成机制方面做了大量的工作，但总体而言多集中于特定的气候、水分、土壤、海拔等宏观生态条件，对与药用植物密切相关的内部微环境研究甚少。直至近些年，随着人们对内生真菌认识的不断深入，内生真菌在道地药材形成过程中的作用才越来越清晰。
首先，内生真菌影响着药用植物的空间地理分布。不少研究表明，在自然界兰科种群中经常出现显著空间聚类现象的一个重要原因，即与生境中内生真菌的丰富度有关____兰科种子离母本越远，必要菌根真菌丰富度越低，萌发成功率越小。而在不同地区，植物内生真菌的种类和丰度有着很大的差异。Tinatin对Chui valley山谷的植被进行了内生真菌分离研究，发现生长在海拔1601～2085m的植株所分离出的内生真菌的种类是海拔2530～3284m植株所分出种类的5倍以上。类似的结果在赵飞的研究中也得到体现。此外，蔡晓布等发现即便内生真菌的优势属相同，但在不同环境中其孢子密度、相对丰度和重要值亦具明显差异。这些差异反映到宿主植物上，最直接的表现即是宿主植物，尤其是那些必须依赖某类内生真菌提供营养物质才能顺利完成其生活史的植物，其分布区域受到限制。换言之，内生真菌是道地药材在特定区域分布的重要原因之一。
除地域专化性，更多的研究表明内生真菌的种群结构与药用植物的品质问存在一定的相关性。王萌等对25个产地丹参中内生真菌的Shannon指数（H）与有效成分进行相关性分析，结果显示内生真菌的丰富性和多样性与丹参主要有效成分丹参素、丹酚酸R的合成和积累呈正相关关系。于海宁等对不同产地仙鹤草中内生真菌的种类和分布进行比较，发现以浙江产的仙鹤草内生真菌的种类最丰富，而浙江产仙鹤草为道地药材，其药用品质最佳。这意味着不同产地的同一药用植物拥有不同的内生真菌种群。而不同的内生真菌以各自不同的方式影响着宿主植物的性状、生长以及有效成分的积累，成为了道地药材与非道地药材品质差异的一个重要原因。
2内生真菌促进药用植物生态种植
研究道地药材的形成机制是发展中药产业过程中保证药材道地性的基础，是指导药用植物合理引种栽培、CAP基地科学规划的重要依据。但仅这些对于药用植物规范化、科学化栽培管理还不够，不良的土壤、不科学的追肥都可能导致所种植的药用植物达不到中药现代化的要求。因此，在科学理论指导下加强药用植物的生态种植，生产绿色药材极为必要而大量研究证实，内生真菌在这方面具有独特的优势。
2.1修复中药材栽培土壤 随着工业化发展和农药化肥不合理使用等加剧，土壤重金属污染已成为一个不可忽视的问题。寻找一个高效、环保的土壤修复方法，从源头上减少中药材重金属污染刻不容缓。据报道，不少植物的内生真菌具有吸附重金属的能力，如从马齿苋中分离的一株内生真菌Lasiodiplodia sp.MXSF31对镉（Cd）、铝（Pb）和锌（Zn）的吸附作用就相当明显。而丛枝菌根真菌菌丝体对Cd的吸附量更是达到了相当于自身干物质质量的13.3%。究其作用机制主要有2个方面，一是内生真菌含有能与过量重金属起螯合作用的半胱氨酸等有机配位体；二是内生真菌丝体细胞壁中带负电荷的自由氨基酸、羧基、羟基、磷酸根以及巯基基团等，对带正电荷的重金属离子具有很强的吸附作用。然而，相比于内生真菌自身作用，植物和内生真菌形成的共生系统对土壤重金属污染的修复作用更为突出Ren等在20 mg·L-1Cd胁迫条件下，发现共生苇状羊茅的重金属耐受性和吸附率明显提高，吸附率甚至达到了对照2.41倍。而Abdul等对内生真菌Penicillium funiculosum LHTB6-植物共生体系的进一步研究发现，内生真菌具有减少重金属诱导的电解外渗和脂质过氧化作用，从而减弱谷胱甘肽活性和脱落酸的合成，提高宿主对重金属的耐受性和转移率这说明内生真菌-植物共生体在土壤重金属污染修复方面具有明显的可行性和实用性而相比于耗时耗力且常可能导致二次污染的常规物理化学修复方法，这种内生真菌一植物共生体修复土壤的方式无疑更适用于药用植物栽前土壤的修复工程
2.2生产高效菌肥 许多内生真菌具有促进宿主植物生长的能力。早在1911年，Kusano就已发现蜜环菌是天麻生活史中必不可少的促生菌而随着对内生真菌研究的深入，大量具有促生效应的内生真菌被发现其中，利用内生真菌Chs-1-1，R2，S3制备的菌剂处理铁皮石斛幼苗后，其鲜、干重均达到了对照的2倍以上，并获得了更高的叶绿素a、叶绿素b、氮、磷、钾以及微量元素的含量。目前从营养供给角度入手是解释这一促生效应的主要途径。在20世纪60年代，国外已有学者证实内生真菌可直接为宿主植物提供生长发育所需的葡萄糖等营养物质。但现代研究发现，相比于直接供给，内生真菌对宿主植物的间接促生作用可能更为重要。在共生状态下，植物拥有众多至少可延伸至根外11.7cm处的根外菌丝。错综复杂的根外菌丝就像一张大网，牢牢的网住所及之处的矿质元素水分等营养物质，促生作用可想而知。这也可能是多具肉质根、几无侧根和根毛的兰科植物生长发育离不开内生真菌的重要原因之一。此外，内生真菌还可以通过诱导植物转运基因的表达来促进其对营养物质的转运和吸收，如从蒺藜状苜蓿根内分离出的高亲和力磷酸盐转运蛋白MtPT4即为菌根化的根所特有。而对内生真菌代谢产物进行研究，可发现内生真菌可产生2类直接或间接对植物具促生效应的化合物——植物激素类物质和磷酸酶。磷酸酶可将土壤中不可给态磷转化为植物可吸收的可给态磷，明显提高土壤肥力；而植物激素类物质则可通过促进宿主根系的生长，提高植物对养分的吸收和利用。
利用内生真菌开发专性菌肥可明显减少化学肥料的使用，对促进药用植物生态种植提高中药材品质具有重要的意义。目前，国际上已有包括我国在内的多个国家生产、应用和推广菌肥，并取得一定的成绩，如蜜环菌菌剂、丛枝菌根真菌菌肥、Roots公司生产的MYCO plox微生物综合调理剂等得到人们广泛的认可。但如何让更多的有益内生真菌运用于药用植物的栽培过程中，开发出更多的更好的专性菌肥仍有待进一步研究。
2.3增强药用植物病虫害抗性 病虫害防治是我国中药材生产最薄弱的一个环节。药用植物的病虫害防治和农药污染之间的矛盾，已成为实现中药材CAP生产的最大难点但近年来，越来越多具有抗病原菌作用的内生真菌被分离出来，仅人参中就分离出不下20种。这些内生真菌种类繁多、抑菌谱广，使人们看到了内生真菌作为生防菌的巨大潜力。大量研究证实，内生真菌可显著提高药用植物在病虫害胁迫下的成活率。通过与内生真菌建立共生关系，铁皮石斛在软腐病病原菌终极腐霉侵染下的存活率超出无菌组192%；而杨树幼苗在回接丛枝菌根真菌后，溃疡病发病率亦有明显下降。
自身合成具有抗病杀虫活性的化合物是内生真菌发挥生防效应的重要机制之一。如从雷公藤中分离到的内生真菌Cryptosporiopsis ef.quercina能合成一种新酰胺生物碱，对稻瘟病害及多种植物病原真菌有极强的抑杀作用。而从大叶醉鱼草中分离出的9种内生真菌，其发酵液对卤虫的校正死亡率达到了100%。此外，内生真菌还可以通过调节宿主内部环境，激发宿主的植物系统抗性来达到生防效应福建金线莲接种内生真菌后，体内几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性均有不同程度地提高就是一个很直观的实例。其中几丁质酶是病原真菌细胞壁中几丁质的主要水解酶，可提高植物抗病性和防御能力；而多酚氧化酶催化多酚类物质氧化成醌类，参与保护植物免受进一步伤害
对菌根化植物的根系组织研究发现，与丛枝菌根真菌共生可加速宿主细胞壁木质化，使根尖表皮加厚、细胞层数增多，根系形态结构改变，从而有效减缓病原体侵染根系的进程。也就是说，除直接抑制或消灭导致病虫害的因子外，内生真菌还可以通过营造“生物壁垒”，减少致病菌和害虫对宿主植物的接触，从而降低病虫害的发生。而内生真菌通过对土壤微生物区系的影响，降低宿主植物根系附近有害菌的比例也很好地支持了这个观点。
3内生真菌有助于中药活性成分的提高
生态种植可保证中药材的种植量与绿色化，但真正发挥药效作用的是其内在的活性成分。活性成分含量的高低是衡量中药材品质好坏最重要的参考指标。大量研究表明，与内生真菌共生可显著提高药用植物活性成分的含量在内生真菌Fusarium mairei的作用下，红豆杉悬浮培养细胞的紫杉醇产量可达到对照组的38倍左右。而可显著提高沉香的结香率、缩短结香时间的内生真菌产香诱导剂也已大规模推向市场，应用于实际生产当中。虽然目前关于药用植物次生代谢信号转导机制的研究仍处于初步探究阶段，但依据科学家们目前所做的工作，如Satheesan等结合Real-time PCR技术发现，与内生真菌共生的积雪草中参与积雪草皂苷代谢过程的关键酶——角鲨烯合成酶和β-香树脂醇合成酶的基因表达明显上调：张莲莲等采用尖孢镰刀菌的细胞壁粗提物诱导红豆杉细胞后，超氧化物歧化酶（SOD）过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活力出现较大变化，紫杉醇的产量较对照提高了近4倍：可以看出，内生真菌可通过中间代谢物诱导宿主植物次生代谢过程中相关基因的转录表达，以提高某些关键酶的活性，从而促进宿主植物代谢产物的合成和积累。这可能是内生真菌发挥促生代谢作用的主要原因之一
除了促进宿主植物次生代谢物的合成，不少内生真菌由于与宿主植物长期协同进化，还具有合成与宿主植物相同或相似有效成分的生理功能。自1993年，Strobel研究小组从太平洋红豆杉树皮中分离到第一株可合成与宿主相同抗癌成分——紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae起，产鬼臼毒素的内生真菌Cephalosprium sp.、产绿原酸的内生真菌、产红景天苷的内生真菌、产西贝母碱的内生真菌F.redolens6WBY3等陆续从各种药用植物中被分离出来。与无内生真菌诱导的药用植物相比，共生系统中的内生真菌相当于为其宿主药用植物活性成分的合成增添了一个新的生产车间；再加上其对宿主植物次生代谢途径的激活作用，自产诱增，使内生真菌在提高药用植物活性成分方面具有明显的双重促进功效。
4内生真菌在中药二次开发中的作用
中药二次开发是对现有中药进行深入研究、改造，使其融入现代科技，更适用于现代医学领域的过程；是从根本上改变我国中药多以原材料形式出口、创新性弱、临床应用受限等现状的必经之路。高品质中药缺乏科技内涵同样难以走向国际。因此，如何充分利用中药现有资源进行二次开发、充分扩展其资源价值，已成为整个中药产业亟待解决的核心问题。
内生真菌具有以中药活性成分的结构类似物为前体，通过结构修饰等过程，将其转化为具更优性能的活性成分的功能。这对充分发挥我国中草药的资源优势，开发具有自主知识产权的新中药具有十分重要的意义。现在，已有一些学者开始注意到开展药用植物内生真菌转化研究的巨大价值，并取得了较好的研究成果。如郑春英课题组在通过内生真菌发酵炮制来提高中药药效成分方面就取得了多项专利在大量实验的基础上，王宇认为内生真菌在与宿主长期共存过程中逐渐形成了对宿主植物的适应机制，可通过自身代谢降解宿主体内的有毒物质，将其转化为无毒物质，从而增强自身生态优势由此可以推测，除作用于一般药材的炮制过程，内生真菌在药用植物生长发育过程中也同样可以发挥减毒增效的作用。王宇等后期的深入研究就证实了这一观点。其结果显示，将内生真菌Gilmaniella sp.接种茅苍术组培苗后，随着时间的推移，茅苍术挥发油的的主要药效成分苍术酮持续增加；而在茅苍术挥发油高含量时，能引发呼吸麻痹等毒副作用的β桉叶醇和茅术醇的含量却逐渐降低。这说明内生真菌在保证药效的基础上，可有效减少中药材的毒副作用，对扩大其临床应用十分重要
除此之外，随着越来越多新转化物的发现，内生真菌对中药成分的转化在开发新活性物质方面的作用也越发明显以龙胆苦苷为底物的发酵实验显示，内生真菌P.crustosum2T01Y01可高效转化龙胆苦苷，并获得4个去糖基的新型转化物。对其中一个新型转化物的护肝活性进行检测，更是惊喜地发现该物质的最小有效浓度远小于龙胆苦苷，护肝活性明显优于其前体物质。类似的，Eu等通过内生真菌Umbelopsis isabellina转化熊果酸得到的2个新活性成分在生物利用率等方面也较前体物质有所提高。这可说明，内生真菌的生物转化作用在开发中药新活性成分方面作用良好，在中药二次开发中具有不可小觑的潜力。
5内生真菌促进珍稀濒危药用植物资源保护
物种资源是一切生物资源开发利用的前提和基础。对于中药生产的全过程而言，中药材资源的可持续发展是其最根本的保障。但目前，由于生态系统的大面积破坏、退化以及人类掠夺式开采，我国野生药用植物资源现状不容乐观仅《中国植物红皮书____稀有濒危植物》第1册收载的354种植物中，药用植物就占了47%。拯救珍稀濒危药用植物资源，实现药用植物的可持续性发展迫在眉睫。
易地保护是保护珍稀濒危药用植物资源最有效的方式之一。从上文可知，内生真菌在药用植物生长发育和品质提高方面作用显著。但生境不同，内生真菌群落结构也千差万别。因而，选择与原生境内生真菌群落结构相近的地方作为迁栖地，对提高珍稀濒危药用植物资源易地保护的成功率极为关键。其中，Ransay对杓兰的引种就是一个成功典例。引种结果显示通过集中调查有潜在共生真菌的生境后再引入杓兰，其存活率可提高至75%以上。而除引种选地，回接促生菌或共生萌发菌在珍稀濒危药用植物资源保护方面同样有着独特的贡献。早在20世纪70年代，徐锦堂从天麻原球茎中分离出12株对天麻种子萌发具有促进作用的内生真菌。其中，天麻与最优菌株紫箕小菇的共生萌发，成功解决了天麻人工栽培中麻种退化的难题，极大地促进了家种天麻的推广，成为天麻保护史和人工栽培史上的一座里程碑。而近年，侯晓强、吴慧凤等将分离得到的多株内生真菌回接至铁皮石斛无菌苗，发现其对幼苗的生长发育作用显著，接菌组的鲜重、新芽数、新根数均达到了对照的2倍以上。依据灭绝可能性与资源丰度和生物量成反比的关系，可以发现内生真菌的应用在保护珍稀濒危药用植物资源方面意义重大。
内生真菌可合成多种药效活性成分，这些活性成分包括萜类化合物生物碱类化合物、黄酮类化合物、苯丙素类化合物甾类化合物糖类等物质，其中大多数生物活性物质具有保健抗癌抗疟杀虫杀菌等特性。如从光黑壳属真菌Preussia sp.代谢产物中获得的螺光黑壳菌酮A（spiro-preussione A），是目前已知的第二个具有螺壬二烯这一特殊骨架的螺二萘类似物。体外活性实验表明，该化合物具有突出的抑制肿瘤细胞和抗微生物活性，是一个极具开发利用价值的真菌次生代谢产物。再加上生长繁殖快、易培养、易控制、产量高，不受季节、气候、地域等自然条件限制等优点，内生真菌已成为开发新型药物的新资源宝库。通过内生真菌发酵或结合基因工程对内生真菌的关键基因资源进行开发利用，可有望突破药用植物资源生长周期长、产量低等局限，成为合成某些关键药物的新途径。就紫杉醇而言，每年全球的销售量超过了500 kg，而每30 t红豆杉树皮中仅能提取1 kg的紫杉醇，寻找紫杉醇新合成途径的需求尤为迫切。目前，尚未见人工合成紫杉醇成熟技术的报道。但已发现，产紫杉醇的内生真菌就多达20多个属，自然分布在多种科属的植物中，这些丰富的内生真菌资源将为人工合成紫杉醇奠定了良好的物质基础，也为保护红豆杉资源提供了物质储备。换言之，丰富的内生真菌资源是保护珍稀濒危药用植物种质资源免受过度开发的有效途径。
6结语
综上所述，内生真菌在揭示药用植物道地性、中药材栽培种植、资源保护和开发利用等方面作用显著。可以得出这样一个结论：内生真菌在中药材领域的广泛应用，将极有可能成为实现中药材优质、高效、安全、稳定、质量可控的新手段新方法。但目前，我国内生真菌在中药材领域的应用仍处于起步阶段，所研究过的内生真菌数量仅为其巨大资源库的很小部分，且多限于对药用植物生长发育、有效成分、抗逆性等表观研究，对其具体作用机制仍不明确。真正商业化的内生真菌产品不多。利用现代技术手段，对内生真菌进行系统研究与开发亟待开展。可以预见，充分利用内生真菌的研究成果将可为中药现代化发展创造新途径，成为推动我国中药产业化规模化国际化发展的新动力。