α－淀粉酶抑制剂的制备及检测α－淀粉酶抑制剂的制备及检测
陕西西安 710049）
摘要：论述了国内外用天然植物和微生物制备具有降血糖作用的α-淀粉酶抑制剂的工艺过程，同时对α-淀粉酶抑制剂的检测方法进行了总结。
关键词：α-淀粉酶抑制剂；制备；检测
中图分类号：Q55文献标识码：B文章编号：1672-979X(2007)02-0034-03
Preparation and Determination of Alpha-amylase Inhibitor
JIA Guang-feng1, 2
(1. Department of Chemistry, Shaanxi Institute of Education, Xi’an, 710061, China;
2. School of Life Science and Technology, Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710049, China)
Abstract：The preparation process of alpha-amylase inhibitor from natural plant and microorganism which has hypoglycemic activity was detailedly discussed in this paper.And main test methods of this inhibitor were detailedly summarized.
Key words：alpha-amylase inhibitor; preparation; determination
α-淀粉酶抑制剂是一种糖苷水解酶抑制剂，能有效抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量水平。人食用后不产生高血糖，从而胰岛素分泌减少，脂肪合成降低，体重减轻。目前在医药和农业上具有广泛的用途，临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等症。农业上α-淀粉酶抑制剂基因可作为抗虫基因，改良植物抗虫性，或者制成生物农药。但目前研究多集中在预防和治疗糖尿病等。
随着生活水平提高和平均寿命的延长，无论是发达国家或发展中国家，糖尿病的患病率都在逐年增加。据估计，目前全世界约有糖尿病患者1.2亿。据WHO最新数据预测，到2010年中国糖尿病患者将达到目前的4倍。防治糖尿病已是一个急迫的任务[1]。目前用于糖尿病治疗的常用药物有胰岛素注射剂、磺脲类及双胍类口服药物，α-淀粉酶抑制剂类药只见有拜糖平。临床试验发现，α-淀粉酶抑制剂类药物的副作用比前几种小，而且作用范围也较前几种广。对不能应用双胍类及磺脲类而又不能使用胰岛素的糖尿病患者，α-淀粉酶抑制剂是一种新型有效药物，可适用于各种类型糖尿病。
由于α-淀粉酶抑制剂在治疗糖尿病和减肥方面有突出的优点，目前生产和制备高纯度的α-淀粉酶抑制剂已成为各国科学家的研究热点。
1α-淀粉酶抑制剂的制备
目前，国内外对于α-淀粉酶抑制剂的研制大都经历以下程序：原料→粉碎→水浸→离心分离→上清液→盐析（沉淀再溶解）→加热灭酶→离心分离→上清液→透析→浓缩→干燥→成品
但是根据原料的不同，α-淀粉酶抑制剂的生产过程又存在着较大的差别，下面就从天然植物和微生物两个方面介绍α-淀粉酶抑制剂的加工工艺。
1.1天然植物α-淀粉酶抑制剂
含α-淀粉酶抑制物的天然植物一般都含有较高的淀粉。符合此特性的植物包括：小麦、大麦和小米[2]，荞麦、豆类、齿苋类、块茎类[3]（红薯、芋头和山药根）等。
1.1.1麦类植物国内，张万山等[4]直接用小麦粉和水以1∶4的比例混合浸提，在5 000 r/min下离心分离出上清液，并经过硫酸铵盐析、水浴加热灭酶、离心分离和醋酸钠溶液透析制得粗品。随后又进行了Sephadex G-75和CM-cellulose柱层析，分别收集了第3峰和第4峰蛋白质，最终制得比活为921.7 U/mg的高纯度α-淀粉酶抑制剂。王转花等[5]研究了甜荞和苦荞2种荞麦的α-淀粉酶抑制剂。他们先用水浸泡荞麦3 h，又用丙酮脱脂，对于脱脂后的荞麦粉再用pH 6.8的磷酸盐缓冲液（含0.3 mol/L NaCl）水浴提取3 h，随后离心分离，上清液在磷酸盐缓冲液中透析，得到活性大于0.037 U/mg的α-淀粉酶抑制剂。
国外，Sugiyama等[6]利用染料配基亲和色谱纯化了硬质小麦和杜伦麦的α-淀粉酶抑制剂。经磷酸盐缓冲液和丙酮梯度洗脱所得α-淀粉酶抑制剂对胰淀粉酶的抑制选择性比唾液淀粉酶更强。Miyazaki等[7]提出了用弱酸、弱碱、水和醇溶液对小麦粉和蛋白粉进行处理，提取α-淀粉酶抑制剂的专利工艺。加工过程中，使用多聚糖对初提上清液进行沉淀，随后用金属离子除去多聚糖，并使用离子交换柱脱除金属离子，得到高抑制活性的α-淀粉酶抑制剂，此种抑制剂对胰岛素没有抑制活性。Franco等[8]将BR35小麦磨碎后，用固液比为1∶5的NaCl溶液提取小麦粉，并经高速离心、硫酸铵沉淀、反相高效液相洗脱层析以及冷冻干燥，最后得到α-淀粉酶抑制剂的成品。
1.1.2豆类植物据报道，菜豆中的α-淀粉酶抑制剂与其它种类相比具有高效价[9]，因其含有几种特殊类型的抑制剂（耐热 heat-stable 和不耐热heat-liable）[10]而倍受国内外研究者关注。Dayler等[11]利用酸性缓冲液从一种名为P. vulgaris的豆中提取出α-淀粉酶抑制剂，用DEAE-Cellulose和反相高效液相特殊设备，经梯度洗脱得到α-淀粉酶抑制剂的异构体α-AI。Yamada等[12]从宽叶菜豆中提取分离出2种α-淀粉酶抑制剂（α-AI-Pa1和α-AI-Pa2）。这2种抑制剂对哺乳动物、细菌和真菌的α-淀粉酶均无抑制作用，对害虫体内α-淀粉酶有抑制作用但表现不同的特异性，其差异性与分子结构有关，其中αAI-Pa1的N端有α和β结构组成，而αAI-Pa2的N端主要包含血凝素。
王贤纯等[13]从豇豆、绿豆、大豆等6种豆科植物籽中提取α-淀粉酶抑制剂。用1％NaCl溶液以5∶1 ～3∶1的液固比加入到豆科籽实颗粒中进行浸提，3 000 r/min离心5 min，收集上清液，置于70 ℃水浴中加热30 min后，在相对离心力为10 000×g下离心30 min，并对上清液进行透析脱盐。在以上各类抑制剂中，只有褐色菜豆的抑制剂除了能特异性地抑制蜚蠊α-淀粉酶外，还能抑制人唾液淀粉酶的活性，但对微生物来源的α-淀粉酶无抑制作用。米切尔·什科普等[14]利用超临界CO2提取技术，从豆类物质中提取和纯化了α-淀粉酶抑制剂用于诱发减肥，并申请了美国和中国专利。
1.1.3齿苋类植物王琳等[15]从野生苋属植物（Amaranthus paniculatus）籽实中分离纯化出α-淀粉酶的一种新型蛋白质类抑制剂，是目前报道的α-淀粉酶的蛋白质类抑制剂中相对分子质量最小的。初步分析结果表明，这种抑制剂由9个氨基酸残基组成，其N端为焦谷氨酸。在弱酸性条件下，它能以非竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道α-淀粉酶的活性，但对人唾液淀粉酶活性无影响。
1.2微生物产生的α-淀粉酶抑制剂
国外对于微生物α-淀粉酶抑制剂的研究开展的较早。1970年Niwa等报道，在一种链霉菌培养液中发现了可以抑制α-淀粉酶的抑制剂诺吉利霉素（Nojirimycin）。日本Narimasa[16]报道了由真菌Cladosporium herbarum F-28（多主枝孢）产生的蛋白类抑制剂，打破了传统认为只有放线菌才能产生抑制剂的意见，并且此种酶抑制剂对哺乳动物α-淀粉酶有极高的特异性。Jajiki等[17]提出了微生物α-淀粉酶抑制剂的纯化方法，主要是将发酵液过滤除去不溶物，滤液中加活性炭吸附，并用乙醇洗脱，经多次柱层析和纸层析，再经Sephadex G-15凝胶柱过滤，最后HPLC分离得单个活性峰，并收集冻干的白色粉末状酶。
国内也有一些微生物研究所、抗菌素研究所进行了酶抑制剂筛选研究工作[18]。福建省微生物研究所从土壤中分离得到能产生α-淀粉酶抑制剂的链霉菌S-2-35菌株。通过鉴别，其培养特性和生理生化特性与蓝色链霉菌（S. coelicoflavus）相比有一定差别，命名为天蓝色链霉菌永春变种。上海医药工业研究院也与日本和美国的多家公司及研究机构共同研究，建立了淀粉酶抑制剂等筛选模型。河北省科学院生物研究所从链霉菌中获得了产生抑制剂的菌种S-19-1，建立了适合S-19-1菌株的发酵工艺，并对其化学性质进行了研究，使发酵滤液中抑制剂活性超过70%。
2α-淀粉酶抑制剂的检测方法
目前，对于α-淀粉酶抑制剂的检测项目主要包括活性、含量、纯度及相对分子质量。文献显示，α-淀粉酶抑制剂一般都为蛋白质类物质，其含量、纯度和相对分子质量都可依照蛋白质的测定方法进行。而抑制活性的测定方法主要包括碘比色法和3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法（Bernfeld法）2种[19]。
2.1碘比色法
测定过程在试管中进行。取0.25 mL浓度为1 mg/mL用磷酸盐缓冲液配制的α-淀粉酶，加入0.25 mL待测液，37 ℃结合30 min。加入1％可溶性淀粉溶液1 mL，37 ℃恒温反应15 min后加碘显色，于660 nm处测定吸光度值。空白管不加淀粉酶和抑制剂，对照管不加抑制剂。根据吸光度的差异计算抑制剂的相对活度。
2.2Bernfeld法
取适量用0.12 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.10）制备的α-淀粉酶储备液，加入100 μL浓度为10 g/L的可溶性淀粉，37 ℃反应5 min。反应完成后加入500 μL 3,5-DNS，沸水浴10 min，取出反应液室温冷却15 min，在546 nm处测定吸光度值。调整抑制剂溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量，使A546 nm的值在0.4～0.7范围内为宜。
程秀丽[20]根据α-淀粉酶活性的测定方法，将淀粉降解产物还原糖在特定条件（添加DNS）下比色，测定其含量，通过标准曲线计算出酶活性，求出α-淀粉酶抑制剂的活性。此种方法可作为高通量筛选抗糖尿病药物的有效方法。
α-淀粉酶抑制剂是目前治疗糖尿病和减肥领域较为安全的一类药物。它广泛分布在许多天然植物中，尤其在麦类和豆类这些大宗粮食作物中含量较高。开发α-淀粉酶抑制剂等产品，有利于激发农民种粮积极性，对增加农民收入有意义。
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注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”