木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表达分析

时间：2023-07-15 17:05:06 来源：正远范文网 本文已影响人

对照植株不施PEG（采用浇灌自来水代替）。在处理0、3和24 h 后，分别收集第1张完全展开叶、未展开叶、老叶和根的样品，-80 ℃保存备用。（3）ABA处理：采用 100 μmol/L ABA溶液进行浇灌处理，在处理0、3、5、7 d 后收集第1张完全展开叶的样品，-80 ℃保存备用。

为了研究不同组织中MeTPP6基因的表达情况，还收集了正常种植条件下木薯Ku50的根（包括须根和储藏根）、茎、叶和叶柄的样本，用于qRT-PCR分析。

1.3 引物合成及qRT-PCR

1.4 生物信息学分析

参照丁泽红等方法[14]进行生物信息学分析，具体描述如下：用BLASTP搜索Phytozome数据库，获取其他物种中与MeTPP6同源的蛋白质序列;用ExPASy ProtParam计算蛋白质的等电点和分子量;用Plant-mPLoc预测亚细胞定位;用NCBI-CDD数据库预测保守结构域;用ClustalX进行序列比对;用MEGA 5.2构建Neighbor-Joining系统进化树;用PlantCARE分析启动子元件;用Primer 5.0软件设计PCR引物。

2 结果与分析

2.1 MeTPP6基因克隆

在前期木薯转录组数据中获得了1个在干旱胁迫下差异表达基因（cassava4.1_009931m.g），之后根据Phytozome木薯数据库提供的参考序列，设计引物进行PCR扩增、凝胶电泳检测（图1）。经测序后获得1条全长为1 122 bp的序列，编码373个氨基酸（图2），根据其与水稻TPP基因的同源性将其命名为MeTPP6。序列比对发现，MeTPP6与参考序列之间仅存在1个碱基差异，可引起氨基酸编码的改变。ProtParam预测MeTPP6蛋白的分子式为C1 876H2 988N510O544S14，总原子数目为5 932，理论等电点（pI值）为9.31，分子量为 41 840.3 ku，不稳定系数为27.48，属于稳定蛋白。亚细胞定位预测该蛋白质定位于液泡或叶绿体。NCBI-CDD保守结构域分析表明，MeTPP6编码的蛋白含有TPP基因家族保守结构域（Trehalose_PPase）（图2），属于木薯TPP基因家族成员。

2.2 MeTPP6系统进化树分析

通过BlastP工具在线搜索Phytozome数据库获取与MeTPP6同源性较高的其他物种中的蛋白质序列，构建系统进化树。聚类后发现，这些基因可以分为3组（图3）：第Ⅰ组包括许多C4植物，如小米、狗尾草、黍羊Panicum hallii、柳枝稷、玉米、高粱和二穗短柄草;水稻TPP基因也被聚类在第Ⅰ组，它与二穗短柄草的同源基因亲缘关系较近，序列相似度高达87.8%。木薯MeTPP6基因被聚类在第Ⅱ组，它与杞柳（SapurV1A.0684s0130.1）和杨树（Potri.005G077200.1）中同源基因的亲缘关系较近，序列相似性分别为89.7%和89.0%。拟南芥TPP基因被聚类在第Ⅲ组，同时还包含了其他十字花科的物种，如白菜型油菜、荠菜花、琴叶拟南芥和鼠耳芥等。

2.3 MeTPP6基因启动子分析

启动子对基因表达起重要调控作用，它决定着基因的转录起始和表达程度。本研究选取MeTPP6起始密码子上游 1 500 bp 的序列进行启动子分析，发现了许多与逆境响应相关的元件，如干旱诱导元件MBS、低温响应元件LTR、低温和干旱响应元件C-repeat/DRE、热胁迫响应元件HSE以及防御与胁迫相关元件TC-rich repeats（表1）。除此之外，还发现了许多与激素响应相关的元件，如水杨酸响应元件TCA-element、茉莉酸响应元件TGACG-motif和CGTCA-motif、赤霉素响应元件P-box和GARE-motif、脱落酸（ABA）响应元件ABRE，以及许多与光响应相关的元件，包括MRE、ACE、G-Box、Sp1和box II等。这些研究结果表明，MeTPP6可能参与木薯干旱、低温、高温、激素和光响应相关的基因表达调控。

2.4 MeTPP6在木薯不同组织中的表达分析

TPS基因的表达量在植物不同组织器官中存在较大差异。本研究考察了MeTPP6基因在木薯Ku50不同组织中的表达情况，结果表明，MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低;茎中表达量较高，约为叶片中表达量的2.1倍;须根和储藏根中表达量最高，分别为叶片中表达量的4.2倍和4.5倍（图4）。这些结果表明，MeTPP6基因主要在木薯的须根和储藏根中起作用。

2.5 MeTPP6在不同胁迫条件下的表达分析

本研究在MeTPP6基因启动子区域发现了干旱、低温和ABA响应相关的元件。为了进一步验证MeTPP6的功能，本研究分别在干旱、低温和ABA处理条件下考察了MeTPP6基因的表达模式（图5）。

在PEG-6000胁迫条件（模拟干旱）下，在处理3、24 h后MeTPP6在老叶中的表达量呈现持续下降的变化趋势，但表达量无显著差异;在第1张完全展开叶中，MeTPP6的表达量呈现先下降后上升的变化趋势，在处理3、24 h后分别下降了19%和上升了1.3倍;在未展开叶，MeTPP6的表达量呈现先不变后上升的变化趋势，在处理24 h后上升了1.8倍;在根中，MeTPP6的表达量呈现持续上升的变化趋势，在处理3、24 h后分别上升了1.3倍和1.5倍（图5-A）。

在低温胁迫下，在未展开叶和第1张完全展开叶，MeTPP6的表达量在处理6、24 h后均呈现持续下降的变化趋势，其表达量分别下降了56%和64%、49%和65%;不同的是，根中MeTPP6的表达量在处理6、24 h后呈现持续上升的变化趋势，其表达量分别上升了3.8倍和8.1倍（图5-B）。

在ABA处理条件下，MeTPP6在叶片中的表达量显著上升了，在处理3、5、7 d后分别上升了1.4倍、1.7倍、1.9倍（图5-C）。

这些结果充分表明，MeTPP6基因在转录水平参与干旱、低温和ABA處理响应，可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。

3 讨论与结论

海藻糖是重要的渗透调节物质，提高植物体内海藻糖含量可以增强植物对干旱、低温等非生物胁迫的抗性[16]。TPS和TPP是海藻糖生物合成途径中的关键酶。与TPS相比，有关植物TPP基因克隆的研究还很少，且大多数报道都集中在模式植物拟南芥和水稻中。拟南芥中共有10个TPP基因，水稻中有13个TPP基因，它们都含有TPP基因家族保守结构域[7-8]。研究表明，提高TPP基因的表达量可以增强植物对逆境胁迫的抗性。在拟南芥中超表达AtPPD基因后，转基因植株抗盐能力增强[17];在水稻中超表达OsTPP1基因后，转基因植株中OsTPP1表达量上升，其对低温、盐和干旱胁迫的抗性增强[7，10]。进一步试验表明，ABA代谢参与OsTPP1基因的表达调控[10]。而且，在玉米中超表达OsTPP1基因后发现，在正常和干旱条件下均可以增加玉米产量[11]。可见，TPP是1个非常重要的抗逆候选基因，可用于作物抗逆遗传改良育种。本研究通过RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因MeTPP6，序列分析表明MeTPP6编码373个氨基酸，含有TPP基因家族保守结构域，属于木薯TPP基因家族成员。进化树分析表明，它与杞柳和杨树中TPP基因的亲缘关系较近，序列相似性分别为89.7%和89.0%。

TPP基因在不同组织中的表达具有较大差异。例如拟南芥AtTPPA、AtTPPF和AtTPPG主要在花粉表达，AtTPPB主要在胚根、侧根以及根的伸长区表达，而AtTPPE主要在子叶和木质部表达[9]，暗示不同TPP成员可能倾向于在不同组织中发挥功能。本研究发现MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低，在须根和储藏根中表达量最高，支持MeTPP6基因主要在木薯的须根和储藏根中起作用。

TPP基因表达受到低温、干旱、盐、机械损伤和渗透胁迫等调控，且不同TPP成员对各种处理的响应不一样。例如，在拟南芥幼苗中，AtTPPE、AtTPPF、AtTPPG和AtTPPJ的表达均受到低温、盐和渗透胁迫的诱导，AtTPPA和AtTPPH的表达仅受到低温胁迫诱导但被盐和渗透胁迫抑制[9]。在根中，AtTPPD、AtTPPF和AtTPPI的表達均受到低温、盐和渗透胁迫的诱导;AtTPPA、AtTPPE和AtTPPG的表达受到低温和盐胁迫的诱导，但对渗透胁迫表现出不同的响应模式;而AtTPPB和AtTPPH的表达则受到低温、盐和渗透胁迫的抑制[9]。此外，不同TPP成员对激素的响应也不一样。AtTPPA和AtTPPB的表达受到ABA处理抑制，AtTPPI和AtTPPD的表达受到ABA处理诱导，而AtTPPE、AtTPPG和AtTPPF的表达则同时受到ABA和JA处理诱导[9]。水稻中OsTPP1基因的表达也受到低温、干旱、盐和外源ABA激素的诱导[7，10]。本研究在MeTPP6启动子区域发现了一系列与干旱、低温、防御和胁迫响应相关的元件，表达分析也进一步证实，MeTPP6基因的表达量受到干旱和低温的调控。植物响应外界非生物胁迫的信号路径主要分为依赖于ABA信号通路和不依赖于ABA信号通路2种[18]。本研究在MeTPP6启动子区域多个位置发现了与ABA响应相关的元件ABRE，且表达分析结果也表明MeTPP6基因表达是响应ABA信号的。因此，本研究推测MeTPP6可能是通过依赖于ABA的信号通路参与木薯干旱和低温等非生物胁迫调控。这些结果将为进一步研究MeTPP6基因在木薯抗逆中的功能提供理论参考。

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