重金属镉对茶树生理特性的影响
摘要：以二年生福鼎大白茶为试验材料，采用盆栽试验方法，探讨了重金属镉胁迫对茶树生理特性的影响。结果表明，在试验设置的镉胁迫浓度范围（5～40 mg/kg）内，镉在茶树叶片中的含量随着镉胁迫浓度的增加而提高，反映出茶树对镉具有富集特性。在生理指标方面，叶片可溶性蛋白含量随着镉胁迫浓度的增加而降低；20 mg/kg以下浓度的镉胁迫能提高茶树叶片的超氧化物歧化酶活性，10 mg/kg以下浓度的镉胁迫能增加茶树叶片的丙二醛、叶绿素、类胡萝卜素的含量；而超过上述镉胁迫浓度后则降低了超氧化物歧化酶活性，减少了丙二醛、叶绿素、类胡萝卜素的含量，并且影响了茶树的正常生长。这个结果可为茶园生产中镉毒害的田间预报、监测指标的确认、数据可信度辨析、污染程度评价等方面提供有价值的参考。
关键词：镉；茶树；胁迫生理
中图分类号：O614.24+2；S571.1；Q945.78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）12-2839-05
Effect of Heavy Metal Cadmium on Physiological Characteristics of Tea Plant
TANG Di，XU Xiao-yan，LI Shu-yan，JIANG Xin-yu
（Jiangsu Agricultural and Forestry Vocational Technical College，Zhenjiang 212400，Jiangsu，China）
Abstract： Using 2-year-old Camellia sinensis （L.） O. Kuntze cv. Fuding Dabaicha as test material， pot method was conducted to explore the effects of heavy metal cadmium stress on physiological characteristics of tea plant. Results showed that in the setting range of cadmium concentration （5～40 mg/kg）， cadmium content in tea plant leaves increased with the increasing of cadmium concentration， showing that tea plant could eich cadmium. In terms of physiological indicators， leaf soluble protein content decreased with the increase of cadmium concentration； cadmium concentration under 20 mg/kg increased superoxide dismutase（SOD） activity in tea plants leaves， cadmium concentration under 10 mg/kg increased chlorophyll， Malondialdehyde（MDA）and carotenoid content. However， higher cadmium concentration decreased SOD activity and MDA， chlorophyll and carotenoid content， and affected normal growth of tea plant. The results could provide valuable reference for field forecasting，identification of monitoring indicators，discrimination of data credibility， assessment of pollution degree in tea garden.
Key words： cadmium； tea plant[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]； physiological characteristics
镉（Cadmium，Cd）是一种生物非必需的重金属元素，其化合物对人类、动物、植物等生物有很强的毒性[1]。由于镉的难降解性和高积累性，导致它能在作物体内大量累积，影响作物的生长发育，造成产量、品质的下降。镉还会通过食物链进入人体，对人类的健康造成威胁。现在我国农田土壤的重金属污染相当严重，其中镉污染的耕地已达1.33万hm2[2]。茶叶是我国的大宗农产品之一，由于工业废弃物排放及化肥、农药的使用不当，茶叶中的重金属污染日趋严重，严重影响了茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]生长及茶叶品质与食品安全[3]，因此加强对茶叶等农产品安全的监测已是迫在眉睫的工作。试验采用盆栽土培的方法，初步研究了镉胁迫对茶树生理特性的影响规律，以期为茶树生长中镉毒害的预报、污染评价提供一定的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验选取江苏农林职业技术学院农场茶园中长势一致的二年生福鼎大白茶（C. sinensis cv. Fuding Dabaicha）为试验材料。盆栽土壤为江苏农林职业技术学院农场耕地的黄壤，将试验用土在阴处晾干，磨细后过20目尼龙网筛。测得土壤pH为6.0，土壤重金属镉的本底值为0.997 mg/kg。试剂主要有KH2PO4、（NH4）2SO4、Cd（NO3）2·4H2O、聚四氟乙烯、HNO3、H2O2、丙酮、乙醇、磷酸缓冲液、碳酸钙、硫代巴比妥酸、考马斯亮蓝G-250溶液等。仪器主要有UV-2100紫外/可见光分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）、TAS990F原子吸收分光光度计（北京普析通用有限公司）、Al104-电子分析天平（瑞士梅特勒托利多有限公司）、XT-9912型智能微波消解仪（上海新拓分析仪器科技有限公司）、ECH-I温控电子加热板（上海新仪微波化学科技有限公司）、SHA-B水浴恒温振荡器（金坛杰瑞尔电器有限公司）、TD5A-WS自动平衡离心机（上海浦仪离心机仪器有限公司）等。
1.2 试验设计
取直径为15 cm的塑料花盆，每盆装入过20目筛的黄壤细土5 kg。每盆土施入3.4 g KH2PO4、5.0 g （NH4）2SO4作为基肥。于2012年4月6日将福鼎大白茶植株用清水洗净后移栽于盆中，每盆2株，经过30 d茶树完全成活后，向盆中分2次施入Cd（NO3）2·4H2O于茶树根部，实施镉胁迫处理。试验设置4个镉胁迫处理，分别施入5、10、20、40 mg/kg的Cd（NO3）2·4H2O，以不加Cd（NO3）2·4H2O作为对照，每处理重复3次。全部处理完成后10 d，摘取各处理（包括CK）的2叶1芽叶片样品，用去离子水冲洗后，立即放入冰箱内冷冻保存，待测。
1.3 测定方法
1.3.1 镉含量测定 准确称取0.5 g鲜叶样品，装于聚四氟乙烯消解杯中，加浓HNO3 5 mL、H2O2 1 mL，于150 ℃电热板加热15 min，转入微波消解仪中消解。然后除酸、定容，采用微波消解-原子吸收分光光度法[4]完成镉含量测定。
1.3.2 色素含量测定 取5 g鲜叶样品，用去离子水洗2遍，用滤纸吸干叶片表面的水分，去掉中脉；用消毒过的手术剪将各处理叶片分别剪碎，称取剪碎的各处理新鲜样品2 g，都3次重复，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及3 mL 95%乙醇，研成匀浆；再加95%乙醇10 mL，继续研磨至组织变白。静置3～5 min。取滤纸1张置于漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻棒将提取液倒入漏斗，滤液流入100 mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取95%乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95%乙醇定容至100 mL，摇匀，待用。叶绿素a（Chlorophyll a，Chl a）、叶绿素b（Chlorophyll b，Chl b）及类胡萝卜素（Carotenoid，Car）的含量采用丙酮-乙醇混合液浸提比色法[4]测定；将叶片叶绿体色素提取液用紫外/可见光分光光度计分别在波长665 nm、649 nm 和470 nm 3个波段处测定吸光度值（A），以95%乙醇为空白对照。依据下列公式[5]分别计算各色素的含量。
叶绿素a：Ca=13.95A 665-2.81A 649；
叶绿素b：Cb=24.96A 649-7.32A 665；
类胡萝卜素：Car=（1 000A470-2.05 Ca-114.80Cb）/245。
1.3.3 其他生理指标测定 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量用硫代巴比妥酸显色法[4]测定；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性用南京建成生物研究所试剂盒法测定；可溶性蛋白（Soluble protein）含量用考马斯亮蓝比色法[4]测定。
2 结果与分析
2.1 镉胁迫对茶树叶片中镉含量的影响
镉胁迫处理对茶树叶片中镉含量及SOD活性、可溶性蛋白和MDA含量的影响结果见表1，茶树叶片中镉含量与镉胁迫处理浓度的关系见图1，由表1、图1可见，经过镉胁迫处理后茶树叶片中镉的含量与没有镉胁迫处理的对照相比都有增长，其中5 mg/kg镉胁迫处理的叶片中镉含量[0.766 mg/kg （FW）]比对照的镉含量[0.656 mg/kg （FW）]提高了16.8%；10 mg/kg镉胁迫处理的叶片中镉含量[0.897 mg/kg （FW）]比对照提高了36.7%；20 mg/kg镉胁迫处理的叶片中镉含量[1.774 mg/kg （FW）]比对照提高了170.4%；40 mg/kg镉胁迫处理的叶片中镉含量[3.401 mg/kg （FW）] 比对照提高了418.4%。由此可知，随着镉胁迫处理浓度的增加，茶树叶片中镉的含量也呈现增加趋势，说明茶树对重金属镉具有富集特性。这与常硕其等[6]、郭艳丽等[7]、李云等[3]的研究结果相吻合。
2.2 镉胁迫对茶树叶片中可溶性蛋白含量的影响
植物体内的可溶性蛋白大多数是参与各种代谢的酶类组分，其含量高低反映了体内细胞总代谢水平的能力大小[7]，从某种意义上说体现了植物生长能力的强弱。镉胁迫处理对茶树叶片中可溶性蛋白含量的影响结果见图2，从表1、图2可以看出，镉胁迫处理后茶树叶片中可溶性蛋白含量出现了明显下降，其中5 mg/kg镉胁迫处理的叶片中可溶性蛋白含量[5.43 mg/g（FW）]只有对照[7.49 mg/g （FW）]的72.5%；10 mg/kg镉胁迫处理的叶片中可溶性蛋白含量[5.20 mg/g（FW）]只有对照的69.4%；20 mg/kg镉胁迫处理的叶片中可溶性蛋白含量[5.06 mg/g （FW）]只有对照的67.6%；40 mg/kg镉胁迫处理的叶片中可溶性蛋白含量[4.77 mg/g （FW）]只有对照的63.7%，表明镉胁迫影响了茶树叶片中可溶性蛋白的合成。随着镉胁迫浓度的增大，可溶性蛋白的合成受到更大程度的抑制，因而可溶性蛋白含量继续降低。这与解莉婧等[8]的研究结果基本一致。
2.3 镉胁迫对茶树叶片中SOD活性的影响
SOD是一种源于生命体的活性物质，是生物体内防御活性氧（Reactive oxygen species，ROS）毒性的保护酶，具有特殊的生理功效[9]。作为生物体内重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体内的氧化物代谢。在正常情况下，植物体内的羟基自由基（·OH）和超氧自由基（·O2-）等ROS的产生与清除处于动态平衡状态之中，如SOD可催化·O2-发生歧化反应而产生H2O2和O2，因而不会伤害植物细胞[10]。但当植物处于胁迫逆境时，由于膜脂过氧化使ROS的产生超过了SOD的清除能力，过量的强氧化物质就会引起生物大分子的变性失活，使·O2-迅速增加，膜透性产生剧烈变化，造成细胞内的物质外渗加快，加剧植物体的损伤。因此SOD的活性体现了植物组织的抗氧化能力，在防御生物体内氧化损伤及抵抗胁迫等方面起着重要的作用[11]，所以SOD活性也可视为植物抗胁迫能力大小的指标，是植物体内清除自由基的首要物质，其活性的大小与植物的抗逆性密切相关[12]。镉胁迫处理对茶树叶片中SOD活性的影响结果见图3，由表1、图3可以看出，茶树叶片中SOD活性随着镉胁迫浓度的升高出现先升高后降低的变化趋势。如5 mg/kg镉胁迫处理的叶片SOD活性[44.15 U/mg（prot）]比对照的SOD活性[43.07 U/mg（prot）]提高了2.5%；10 mg/kg镉胁迫处理的叶片SOD活性[48.44 U/mg（prot）]比对照提高了12.5%；20 mg/kg镉胁迫处理的叶片SOD活性[64.36 U/mg（prot）]比对照提高了49.4 %；而40 mg/kg镉胁迫处理的叶片SOD活性[45.62 U/mg（prot）]只比对照提高了5.9%；显而易见，SOD活性以在20 mg/kg镉胁迫处理时达到最大值。这与常硕其等[6]加锰处理茶树的研究、骆耀平等[13]加铅处理茶树的研究、钟珍梅等[2]对圆叶决明（Chamaecrista rotundifolia Greene.）的研究结果相一致。即重金属轻度胁迫条件下SOD活性增强，重度胁迫下SOD活性下降。这可能是当茶树受低浓度镉胁迫后，茶树体内活性氧含量增加，SOD酶系统被激活以应对镉胁迫，故SOD活性增加，而当镉浓度达到一定水平时，引起蛋白质变性，故SOD活性降低。
2.4 镉胁迫对茶树叶片中MDA含量的影响
MDA是植物在受到逆境胁迫时，细胞膜发生过氧化作用或脱脂作用而产生的最终产物，其含量的高低可以反映植物遭受逆境伤害的程度，是表达植物膜系统受伤害程度的重要指标之一。镉胁迫处理对茶树叶片中MDA含量的影响结果见图4，从表1、图4可以看出，经过镉胁迫处理的茶树叶片MDA含量都高于对照的MDA含量，其中5 mg/kg镉胁迫处理的叶片中MDA含量[11.21 μmol/g（FW）]比对照的MDA含量[10.59 μmol/g（FW）]提高了5.9%；10 mg/kg镉胁迫处理的叶片中MDA含量[16.85 μmol/g（FW）]比对照提高了59.1%；20 mg/kg镉胁迫处理的叶片中MDA含量[12.40 μmol/g（FW）]比对照提高了17.1%；40 mg/kg镉胁迫处理的叶片中MDA含量[12.14 μmol/g（FW）] 比对照提高了14.6%；显而易见，在镉胁迫浓度为10 mg/kg时MDA含量达到最大值，而后茶树叶片的MDA含量随着镉胁迫浓度的增加有所下降。这是植物受到镉胁迫后，通过调节自身的MDA含量来应对外来的胁迫伤害特性所决定的，这与常硕其等[6]研究锰对茶树生理变化的影响、丁波等[14]研究锌对粗壮女贞[Ligustrum robustum（Roxb.）Bl.]生理特征的影响、夏建国等[15]研究镉胁迫对蒙山古茶树生长及叶片生理指标影响的结果中植物受到重金属胁迫后体内MDA含量“先升高、后降低”的情况是类似的。
2.5 镉胁迫对茶树叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量的影响
植物体内的光合色素（主要是叶绿素）是光合作用的重要基础，其中的叶绿素是植物生长发育的重要营养来源，是反映植物叶片生长状况的重要生理指标，其在光合作用中参与植物对光能的吸收、传递和转化，其中叶绿素含量的变化既可直接反映植物叶片光合作用功能的强弱，也可用来表征逆境胁迫下植物组织、器官的损害程度与衰老状况[16，17]，因此在胁迫背景下植物叶绿素的含量高低体现了植物抗胁迫能力的大小[18，19]，往往可以作为植物机体反映环境胁迫程度的重要生理指标。类胡萝卜素既是光合色素的一部分，也是活性氧清除系统中非酶促系列的成员之一，它可直接捕获氧自由基而阻断氧自由基的链式反应，防止氧自由基对蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤，进而有效地延缓植物的衰老[20]。镉胁迫处理对茶树叶片中光合色素含量的影响结果见表2、图5，从表2、图5可以看出，茶树叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量随着镉胁迫浓度的升高出现先升高后降低的变化趋势。如在5 mg/kg镉胁迫处理的叶绿素含量[2.50 mg/g（FW）]比对照的叶绿素含量[2.32 mg/g（FW）] 提高了7.8%，类胡萝卜素含量[0.76 mg/g （FW）]比对照的类胡萝卜素含量[0.69 mg/kg （FW）] 提高了10.1%；在10 mg/kg镉胁迫处理的叶片叶绿素含量[2.72 mg/g（FW）]比对照的提高了17.2 %，类胡萝卜素含量[0.85 mg/g （FW）]比对照的] 提高了23.2%；而在20 mg/kg镉胁迫处理的叶片叶绿素含量[2.20 mg/g（FW）]比对照反而降低了5.2 %，类胡萝卜素含量[0.67 mg/g （FW）] 比对照反而降低了2.9%；到了40 mg/kg镉胁迫处理时降低的幅度更大，叶片叶绿素含量[1.94 mg/g（FW）]比对照降低了16.4%，类胡萝卜素含量[0.63 mg/g （FW）] 比对照降低了8.7%。茶树叶片的叶绿素含量在低浓度镉胁迫下小幅度上升，这可能是叶绿素合成系统的一种应激性反应。随着镉胁迫浓度的升高，重金属镉可能破坏了叶绿体合成蛋白酶的活性和线粒体的结构，导致叶绿素降解，代谢出现紊乱，导致叶绿素含量逐渐降低。这个试验结果与乔琳等[21]比较重金属对白菜（Brassica pekinensis Rupr.）幼苗叶绿素的影响研究、郭艳丽等[7]研究镉对向日葵（Helianthus annuus L.）幼苗的影响以及丁波等[14]试验锌处理对粗壮女贞生理特性的影响等研究的结果是一致的。
3 小结
试验结果显示，茶树在镉胁迫的环境里，随着镉胁迫浓度的增加（5～40 mg/kg），茶树叶片中的镉含量也呈现增加趋势，反映出茶树对重金属镉具有富集特性。由于镉的毒性和难降解性，进入茶树体内后会影响茶树蛋白质的合成，造成茶树叶片中可溶性蛋白的含量减少，使茶树的生长能力变弱，影响茶树的正常代谢，这将会造成茶叶品质的下降，产生食品安全问题。和大多数植物的胁迫生理特点类似，20 mg/kg以下浓度的镉能提高茶树叶片的超氧化物歧化酶活性，10 mg/kg以下浓度的镉能增加茶树叶片的丙二醛、叶绿素、类胡萝卜素的含量；而超过上述数值的镉浓度则降低了超氧化物歧化酶活性，减少了丙二醛、叶绿素、类胡萝卜素的含量，并且影响了茶树的正常生长。因此在对茶园进行农事管理如施肥、打农药时，要严格控制好镉的引入，避免因重金属污染而降低茶叶的品质、减少茶叶产量、给农民造成不必要的经济损失等情况出现，尤其是各地要重视重金属镉会通过食物链进入人体而带来一系列的食品安全问题，强化对茶叶等农产品安全的监测工作，尽快建立包括茶叶在内的农产品重金属污染的评价与预报机制[22]，从而为老百姓的餐桌提供满意放心的安全食品。
另外，试验结果为茶园生产中镉毒害的田间预报、监测指标的确认、数据可信度辨析、污染程度评价等方面提供了一定的参考；下一步将继续深化与扩大探讨镉胁迫对茶树更多生理指标的影响，争取建立一个全面完整的农产品重金属污染监测体系。
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