（1，3）—β—D葡聚糖检测在恶性血液病患者侵袭性真菌病早期诊断中的临床价值*
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【摘要】 目的：探讨采用（1，3）-β-D葡聚糖对于临床诊断恶性血液病患者侵袭性真菌病（IFD）的价值。方法：选择2013年2月-2015年1月本院收治的确诊或疑似IFD恶性血液病患者80例作为研究对象，检测并比较不同诊断标准下（1，3）-β-D葡聚糖水平及其敏感性、特异性。结果：不同诊断标准下，血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平阳性检测率分别为72.50%、87.50%，比较差异有统计学意义（P<0.05）；以≥60 pg/mL为阳性标准时其敏感性、阴性预测值比≥80 pg/mL为阳性标准时明显要高，差异有统计学意义（P<0.05）；而两种标准下试验的特异性、阳性预测值比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：实施（1，3）-β-D葡聚糖检测可以对IFD患者予以早期诊断，临床推广意义重大。
【关键词】 （1，3）-β-D葡聚糖； 恶性血液病； 侵袭性真菌病
恶性血液病患者因治疗的需要，长期接受大剂量化疗，其间不断接触抗菌类药物、免疫抑制剂等，所以导致IFD（Invasive fungal disease，侵袭性真菌病）的风险较大[1-2]。IFD发病急速，预后不好，成为导致血液病患者死亡的重要原因。当前，临床诊断IFD的传统方式是进行病原体培养或组织病理学检查，对专业技术的要求较高，同时耗费时间较长，敏感度也相对较低，所以难以早期确诊。加之组织病理活检和深部组织培养检测具有创伤性，不适用于血小板减少、凝血功能延长及其他类型的危重恶性血液病患者，给IFD的临床诊治造成诸多不利影响[3]。侵袭性真菌感染的临床治疗效果及预后与患者的感染程度具有密切关联，同时临床治疗时机对其临床疗效也存在一定影响，早期诊断并及时采取治疗措施对侵袭性真菌感染的临床治疗具有至关重要的作用。据报道称，通过检测血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平对IFD的早期诊断价值较高[4-6]。本研究选取本院确诊或者怀疑IFD的恶性血液患者80例，通过（1，3）-β-D葡聚糖含量检测（G试验），探究其诊断对IFD的临床价值，具体报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2013年2月-2015年1月本院确诊或疑似IFD的血液病患者80例为研究对象，其中男55例，女25例；年龄14～65岁，平均（41.54±4.26）岁。全部患者均发热超过37.5 ℃，均实施4 d广谱抗菌药物治疗未见效果。所有患者均具有IFD宿主因素，包括：中性粒细胞缺乏、长期使用糖皮质激素和/或免疫抑制剂、侵袭性真菌感染病史、同时患有免疫缺陷病；均接受血培养和影像学检查，其原发病分别为急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。
1.2 诊断标准 根据《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第四次修订版）》（中国IFD工作组2013年修订）进行。（1）确诊IFD组：组织病理学证实为真菌，无菌组织及血液培养为真菌；（2）临床诊断IFD组：具有至少1项宿主因素、1项临床标准及1项微生物学标准；（3）拟诊IFD组：具有至少1项宿主因素、1项临床标准，而缺乏微生物学标准；（4）未确定IFD组：具有至少1项宿主因素，临床证据及微生物结果不符合确诊、临床诊断及拟诊IFD标准。排除标准：不符合以上诊断标准，且单纯实施抗菌药物治疗效果显著者[7]。
1.3 判定标准 （1，3）-β-D-葡聚糖含量
<60 pg/mL为阴性，≥80 pg/mL为阳性，（1，3）-β-D-葡聚糖含量60～79 pg/mL为不明确结果，提示可能存在真菌感染，需要重新取样进行检测，多次采样检测可以改善检测的效能。
1.4 血浆（1，3）-β-D葡聚糖检测（G试验） 仪器：TAL-80E恒温仪与KLAM-02-64动态比浊仪。方法：采用含有少许无菌抗凝剂肝素钠的无热原玻璃注射器或者一次性真空采血管分别采取待测患者静脉血2 mL，为了避免管口发生污染，需要进行灭菌铝箔封闭管口，并使用3000 r/min 离心60 s，取出得到的血小板血浆，立即放入冰水浴中，以便备用，如果暂时不用，可以将离心血浆放置于-30 ℃的冰箱中存放。血浆样品的制作过程：取血小板血浆0.1 mL与0.9 mL的样品处理液混合，混合均匀后保温15 min左右，检测时立即取出并放入冰水浴中，所得混合液即为待测血浆样品。依照标准操作规程，应用Fungitell法检测血样中（1，3）-β-D-葡聚糖的水平。取待测血浆0.2 mL加入酶反应主剂中，当血浆溶解后，采用微量加样器将其转移至标准玻璃反应管中，本研究采用10 mm×75 mm规格的标准玻璃反应管，切记不可使其产生气泡，并将其插入MB-80微生物快熟动态检测系统中进行化学反应，反应结束后即可自动计算出待测血浆中的（1，3）-β-D-葡聚糖质量浓度。
1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计学分析，计量数据以（x±s）表示，比较采用配对t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者诊断结果情况 所有患者中确诊IFD组1例，临床诊断IFD组8例，拟诊IFD组40例，未确定IFD组31例。
2.2 患者不同血浆（1，3）-β-D葡聚糖诊断标准阳性率及排除率比较 分别以血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平≥80 pg/mL及≥60 pg/mL作为阳性诊断标准，比较其阳性检测率。结果显示，血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平≥80 pg/mL诊断标准下，患者血浆
（1，3）-β-D葡聚糖水平阳性检测率为72.50%，而血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平≥60 pg/mL诊断标准下，其血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平阳性检测率为87.50%，不同诊断标准下，检测阳性率比较差异有统计学意义（ 字2=5.63，P<0.05），见表1。
*与≥60 pg/mL比较，P<0.05
2.3 不同诊断标准敏感性、特异性情况比较 在不同诊断标准下，G试验的阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为90.41%、73.97%和89.04%、86.30%。确诊组及临床诊断组G试验均阳性，在40例拟诊病例中，有28例G试验阳性，且对广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗有效，经过临床回顾性分析符合IFD，表明G试验使IFD诊断率提高30.0%，未确定组有5例G试验阳性。以血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平≥60 pg/mL为阳性标准时，其G试验敏感性、阴性预测值明显高于以≥80 pg/ml为阳性标准，差异有统计学意义（P<0.05）；而两种标准下G试验的特异性、阳性预测值比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
3 讨论
侵袭性真菌病（IFD）好发于严重免疫低下患者，而血液病患者往往首当其冲，尤其是恶性血液病患者，由于长期或反复接受高强度化疗、广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂，IFD的发病率增加[8]。国内一项前瞻性、多中心流行病学研究（CAESAR研究）显示，在接受化疗的恶性血液病患者中，IFD的总体发生率为2.1%，尤其是在急性白血病诱导化疗期间，病原菌以念珠菌及曲霉菌为主[9-10]。而与之相对的是其漏诊率及病死率也高，国外数据显示念珠菌病的病死率为39%，曲霉菌病的病死率为49.3%，严重影响患者预后，是恶性血液病患者死亡的原因之一。IFD属于恶性血液病并发症，临床较为普遍。研究显示，对于该病症的良好疗效及预后，不仅与患者的病情严重程度相关，更与其准确的治疗时机密不可分[11-12]。因此，该症的早期诊断对于实施有效的治疗措施临床意义重大。目前，该症的传统诊断方法通常包括细菌培养和病理检查。由于病理检查对患者有创伤且不易取材，标本容易遭受药物、环境污染，真菌培养耗时较长等缺陷，加之检测结果存在相当大的假阳性率、假阴性率，所以传统的诊断方法具有较大的局限性，极大可能会造成最佳治疗时机的错失[13]。而如果仅仅根据经验进行抗菌治疗，其昂贵的费用及其药物副作用势必给患者及医院带来诸多不利影响。基于此，医学研究者积极探究及时迅速且精确诊断IFD的有效方法，其临床意义至关重要。目前，国外及国内IFD诊断标准可归为2条，其一活组织标本或者组织病理学在正常情况下的无菌腔液培养呈现阳性；其二，患者的累及部位不明确，难以实施侵入性检查，针对严重血液病合并其他感染性疾病的患者难以及时确诊[14-15]。再加上传统真菌检测方法的检出率不高，一般来说，痰培养曲霉菌的检出率仅仅只有8%～34%。近年来，医学界备受关注探究早期诊断IFD的方法是进行血清学检测，即血清（1，3）-β-D葡聚糖检测（G试验）。研究表明，（1，3）-β-D葡聚糖普遍存在于真菌细胞壁，占其50%以上，而人体、细菌、病毒及其他病原菌细胞不存在此成分。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。在浅部真菌感染中，
（1，3）-β-D-葡聚糖未被释放出来，其在体液中的量不增高，因此可用检测（1，3）-β-D-葡聚糖诊断侵袭性真菌病，并且（1，3）-β-D-葡聚糖检测阳性对于诊断IFD有较好的特异性。国内外已有大量资料显示G试验检测阳性一般先于临床症状平均4 d出现，血液G值升高平均早于发热5 d，早于呼吸道症状平均10.7 d，早于胸部高分辨CT（HRCT）检查平均9.3 d，且耗时短，检测时间<2 h，因此对IFD的早期诊断具有重要的参考价值[16]。
G试验在临床IFD诊断中的应用价值已经逐渐受到了广大研究者的青睐，而2008年的深部真菌感染诊断标准也正式将G试验纳入微生物学诊断标准，极大地提高了IFD的诊断率，因此，（1，3）-β-D-葡聚糖可以作为IFD早期无创检测诊断的重要指标之一[17]。如果能够充分利用G试验就可以明显减少诊断所用时间，能够早期及时的对疾病治疗采取相应的治疗措施。
以往对于恶性血液病患者出现中性粒细胞缺乏并持续或反复发热，广谱抗生素治疗4～7 d无效，或初起有效但3～7 d后出现不明原因发热时，主张经验性抗真菌治疗。由于该治疗策略缺乏特异性的持续发热作为起始标志，因而会出现过度应用抗真菌药物的可能，从而带来药物相关毒性和花费增加的弊端，而延误治疗又导致病死率增加。因此，IFD早期诊断实验室检查的开展有利于减少抗真菌药物的不必要使用，指导临床合理应用抗生素，从而使广大患者获益[18]。值得注意的是，透析、溶血、黄疸或输注白蛋白、免疫球蛋白，甚至某些细菌感染（尤其是链球菌菌血症）也会导致其假阳性，而造成假阳性的主要原因是抗真菌药物的预防性应用，对此可采取多次检测的方法降低假阳性、假阴性的发生率。因此，在临床工作中应结合患者高危因素、病情等对G试验的结果做出合理的判断。
尽管G试验只能通过早期诊断恶性血液病患者是否受到真菌感染而无法准确判断真菌的种类，但应用于临床把握诊治IFD的最佳时机具有极其关键的意义。通过对58例（1，3）-β-D葡聚糖水平≥80 pg/mL的IFD患者采取抗真菌治疗，效果显著，除1例患者无效失败外，其余患者（1，3）-β-D葡聚糖水平均有显著降低。
总之，应用（1，3）-β-D葡聚糖检测具有较高的敏感性，能够对IFD患者予以早期诊断，为临床干预治疗节约诊断时间，同时有效避免IFD的发生，降低患者致亡率。此外，可以结合G试验的良好阴性预测值排除IFD，合理规范使用抗真菌药物。
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（收稿日期：2015-12-08） （本文编辑：刘蕾）