筛选浙贝母内生真菌以及抑菌活性菌株性质研究
摘 要：目的：对浙贝母内生真菌以及抑菌活性菌株性质进行分析探讨，为今后的研究工作提供可靠的理论依据。方法：采取组织分离印迹对照法自浙贝母植株中分离内生真菌，经牛津杯法对抑菌活性进行筛选，对活性菌株展开发酵培养，并绘制出抑菌活性变化曲线、培养基消耗曲线以及次生代谢产物浓度变化曲线，经高效发酵体系对抑菌活性菌株进行发酵，分离浓缩发酵液后，进行萃取分离。结果：经统计试验中共获得36种内生真菌，低下鳞茎中分离的BJ7具有很高的抑菌活性；发酵9天时的BJ7抑菌活性最佳。结论：浙贝母中可分离得到多种内生真菌，其中以BJ7的抑菌活性最高，应对其给予重视。
关键词：浙贝母；内生真菌；抑菌活性；菌株性质；分离纯化
本次研究中出于对浙贝母内生真菌以及抑菌活性菌株性质进行分析探讨的目的，采取多种分离、纯化、培养手段对浙贝母中内生真菌以及抑菌活性菌株进行了分离研究，现汇报结果如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
试验药物：宁波鄞州所产浙贝母，在花期采集地上和低下两部分，清洗干净后保存在4℃的环境中。
培养基：浙贝母内生真菌分离与纯化的培养基选择PDA培养基[1]，组成包括：土豆浓度为200g/l，葡萄糖浓度为20g/l，琼脂浓度为20g/l；采取LB培养基作为细菌类的指示菌[2]，组成包括：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，pH7.4；真菌发酵采取查氏优化液培养基[3]，组成包括：蛋白胨0.5%，KCL0.05%，葡萄糖8%，K2HPO40.1%，MgSO40.15%，pH6.5。
指示菌：试验中指示菌选择金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌的分离纯化
取新鲜、无虫害的浙贝母，分叶、茎、地下鳞茎等三个组成部分，采用浓度为75%的酒精浸泡1min左右之后，经无菌水进行反复冲洗，冲洗次数控制在3-4次之间，在采用浓度为0.1%的升汞中浸泡5min左右，再采用无菌水进行反复冲洗，冲洗次数控制3-4次之间，经解剖刀将外植体切块，大小控制在5mm×5mm，接种到PDA培养基中，防止在28℃的培养箱中，并保证避光培养3-5天，然后待边缘长出菌丝，挑取边缘生长状况良好的单一菌丝，接种在新配置PDA培养基中，长成菌落后再挑取边缘菌丝培养，如此反复进行菌株纯化处理，观察菌落的具体生长情况。分离纯化操作结束之后，重复进行上述实验操作，采取同样的方法实施再次的分离纯化处理，最后将分离后得到的真菌与第一次分离处理后得到的真菌进行对比观察，对真菌的内生以及来源进行确定，实验过程中应该设置空白平板作为对照观察。
1.2.2 抑菌活性的测定
将研究所需要的菌株接种到新鲜PDA平板上，在28℃的条件下进行培养一个星期左右，当真菌已经长满整个平板的时候，可以经试管口在平板上压出一个大小一致的PDA培养基圆饼，取出后放置在涂有三种细菌液的LB培养基，在28℃的条件下进行培养一天的时间，仔细观察对圆饼周围是否有抑菌圈出现，将无菌培养基作为空白对照观察。
2 结果
2.1 内生真菌的菌落特征
新鲜浙贝母经分离处理后得到36种真菌，叶中分离处理后得到14种真菌，占38.89%，自茎中分离得到9种，占25.00%，地下鳞茎中分离处理后得到13种真菌，占36.11%。
2.2 活性菌株的筛选与鉴定
低下鳞茎分离处理后得到BJ菌株，对临床上常见的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均具有非常明显的抑菌作用。菌株正面呈绒毛状，黄绿色，边缘呈纤毛状，培养基腹面能够观察到棕黄色菌株，镜下孢子梗呈长链状，有特有形态。将内生真菌菌丝提取的基因组作为模板，经进行PCR扩增，并对扩增产物实施电泳，PCR扩增产物表现单一明亮，片段在750bp左右，与预期的大小基本一致，试验中将基因序列与NCBI基因库进行了对比结果发现该序列与曲霉属Aspergillus sp.的相似度为100%，结合形态学特征分析证实活性菌株为Aspergillus sp.BJ7。
2.3 Aspergillus sp.BJ7性质初步研究结果
经观察发现，发酵液自滴5天开始出现明显的抑菌效果，在第9天时得到峰值，培养基在2-7天时开始快速降低，在第8-12天时保持平稳，证实Aspergillus sp.BJ7在第8天后基本停止生长繁殖。通过观察组第1-12天的发酵液吸光值发现，Aspergillus sp.BJ7的次生代谢产物浓度在第5天时达到峰值，在第8-9天时达到最低值，且保持平稳，发酵液在60被稀释后失去了抑菌活性，由此可推断，Aspergillus sp.BJ7在第2-7天之间属于快速生长期，从第8天开始会有次生代谢产物大量出现，抑菌效果从第10天开始呈现逐渐的降低的发展趋势。
3 讨论
临床上应用的中药材浙贝母为百合科贝母属多年生草本植物的一种，生物碱是其主要有效成分，贝母素甲和贝母素乙是最为常见的两种，属于异甾体生物碱类物质的一种。浙贝母的主要功效作用为止咳、清热化痰、开郁散结，临床主要应用该药物对上呼吸道感染、胃十二指肠溃疡、咽喉肿痛、支气管炎、甲状腺肿大、肺热咳嗽、乳腺炎等疾病进行治疗，效果非常理想[4]。近期有研究发现，浙贝母中可分离多种内生真菌[5]。由本次试验可以发现，真菌在浙贝母植株中的分布以叶和地下鳞茎为主，其次为茎中。试验中观察到，发酵液抑菌活性从第9天开始呈现不断降低的趋势，主要由于抑菌活性物质属于碱性类物质，Aspergillus sp.BJ7在生长后期会有酸性物质大量分泌，两者发生中和反应，或对抑菌活性物质造成严重的破坏，也可能是抑菌活性物质在Aspergillus sp.BJ7生长后期被分解利用，进而引起发酵抑菌活性逐渐降低[6]。
综上所述，浙贝母中内生真菌代谢产物可以对革兰阳性菌、格兰阴性菌产生较为普遍的抑菌作用，证实浙贝母中内生真菌存在广泛的抑菌活性物质，经分离纯化与鉴定发现，其主要抑菌活性菌株为Aspergillus sp.BJ7，值得人们对其给予足够的重视。
参考文献
[1]田峰，何仁发，李明月，等.浙贝母内生真菌菌珠FTJZZJ09及其抑菌活性成分[J].微生物学通报，2010，37（10）：93.
[2]叶波平，张少华，刘冰，等.浙贝母内生真菌Nectria sp.JZ6分泌抑菌活性代谢产物的初步研究[J].菌物学报，2009，28（04）：603.
[3]颜霞，李希尧，李伟国.喜树内生真菌的分离及其代谢产物的初步研究[J].西北农业学报，2008，17（03）：315.
[4]董庆霖，陈博，邢向英，等.一株蓝藻内生真菌的鉴定及其产物抑菌活性[J].化工学报，2011，14（06）：1023-1024.
[5]祝兴伟，张少华，王治维，等.一株来自于伊犁贝母的内生尖孢镰孢菌Y1的抑菌活性初步研究[J].菌物学报，2009，15（03）：332-334.
[6]王艳红，徐磊，杨信东，等.温莪术内生真菌的分离及其抗菌活性的初步研究[J].中国药学杂志，2009，16（13）：213-215.
作者简介：陈弘毅（1984，8-），男，籍贯：浙江上虞，研究方向：药物菌体筛选发酵提取及研制研究。