复方松针提取物的质量控制研究
【摘要】 目的 测定复方松针提取物的化学成分和含量,为其质量控制提出理论依据。
方法 以无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚为溶剂,对复方松针水提取两次之后的浓缩液进行分级萃取的方法提取得到挥发油,利用RPHPLC,FOURIERNIR,NMR,MR等表征手段对其化学成分进行分析鉴定。应用色谱技术分离纯化,用傅里叶红外光谱(IR),质谱(MS)等波谱方法对其萃取物进行全面的表征。结果从复方松针提取物中,主要成分含饱和脂肪醇和饱和脂肪酸类,其余主要是萜烯类。结论 该方法简便易行,准确可靠,可以为复方松针提取物的质量控制提供依据。
【关键词】 复方松针消臭液;提取物;质量控制
文章编号:1003-1383(2010)04-0407-02 中图分类号:R 927.11 文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.04.012
复方松针消臭液中使用的主要原料药材是松科植物马尾松(学名:pinus massoniana lamb),分布极广,其味苦,性温,归心,脾经,具有祛风燥湿,杀虫止痒的功效,是我国南部主要材用树种,经济价值高[1]。《本草纲目》记载:“松为百木之长,松针主治风湿疱,生毛发,安五脏。不饥延年……可入药疗疾。”但是由于中药制剂成分复杂,药材的批次之间的均一性差,生产过程中存在的粗放型的操作,对其质量的可控性不高,因此如何保证其质量的稳定可靠性,是我们亟待解决的问题。本课题研究中,对复方松针提取物的化学结构表征方面展开论述,为其质量控制提供理论依据。
材料和方法
1.材料
(1)药物与试剂 复方松针原料药,无水乙醇,乙酸乙酯,石油醚,均为分析纯,甲醇,乙腈,醋酸均为色谱纯。
(2)实验仪器 质谱条件:EI离子源,电子能量70 eV,离子源温度为230℃,质量范围50～500 amu,扫描方式:全扫描。检索谱库:Datebase/Nist98.L。NMR型号为:Bruker400核磁共振仪,IR条件为BIORADPC8201光谱,Waters高效液相色谱仪。
2.提取方法
(1)水提取物 复方松针药材约(100 g)用沸水提取两次,过滤,把两次的滤液合并,旋转蒸发仪浓缩至浸膏状,得浸膏约14 g,放置于4℃冰箱静置48 h后,除去下层沉淀物,取上清液,至真空干燥器中,真空干燥24小时(备用)。
(2)有机溶剂萃取物 依次用无水乙醇,乙酸乙酯,石油醚,对水提物进行萃取。用乙酸乙酯萃取,得到萃取产物3 g,上硅胶柱进行分离,用石油醚甲醇溶剂系统进行洗脱,约50 ml为一个流份(浓缩后收集备用)。把浓缩后的组分点薄层硅胶板,在合并Rf值相同的组分,合并的组分在甲醇中进行重结晶,得到产物。
3.结构表征
(1)化合物1 为白色粉末状产物。可溶于乙酸乙酯和乙醚,FeCl3[K3Fe(CN)6]反应呈阳性,说明产物成分中含有羟基基团。与H2SO4茴香醛反应呈蓝色。IR(KBr压片)cm-1:3487,3220,2925,1609,1517,464,1275,1127,1032,667,表明是吡喃葡萄糖苷的结构骨架,1HNMR光谱表征的时候,在5.41(1H,d,J=6.4Hz,7H)的时候出现双信号,说明7H和8H出现形变。NOESY实验表明在7H和9H,9H和6"H之间的有NOEY耦合效应。所有这些证据表明,7位C和8位C的构型是7S,8R。在δ4.30(1H,d,J7.6Hz)端基异构质子信号表明有βD葡萄糖苷键。HMBC试验表明,Glu1′′H(δ4.3)和9C(δ71.38)有连接,葡萄糖和配基的连接位置是9C上的羟基。基于以上证据,化合物1被表征为(7S,8R)4,9′二羟3,3"二甲氧基7,8二氢苯并呋喃1′丙基木脂素9OβD吡喃葡萄糖苷,数据与文献报道的相一致[2]。
(2)化合物2 为棕黄色不定型粉末,极易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚,但不溶于水,与FeCl3[K3Fe(CN)6]反应显阳性,表明含有羟基,与1%的茴香醛浓硫酸加热显红色。1H NMR(在丙酮d6,δ):7.01(2H,d,J=8.4Hz,2′,6′H),6.77(2H,d,J=8.4Hz,3′,5′H),2.82(2H,tJ=7.2Hz,4H),2.71(2H,t,J=7.2Hz,3H),2.14(3H,s,1H).13C NMR在丙酮d6,δ):210.29(2C, 154.23(4′C),132.217(1′C),129.21(2′,6′C),115.32(3′,5′C),45.37(4C),30.05(3C),28.74(1C)。化合物的结构在1H NMR和13C NMR下数据表征为4(4′羟基苄基)2丁酮。该结果与文献报道的相一致[3]。
(3)化合物3 为黄色粉末,mp.313℃(MeOH)。UVλmax (MeOH,nm):369,258,208;IRV(KBr)cm1:3434,1624,1610,1518,1426,1349,1310; 1H NMR(CD3OD)δ:7.73(1H,d,J=2.4Hz,H2′),7.63(1H,dd,J=8.0,2.4Hz,H6′) 6.88(1H,d,J=8.0Hz,H5′),6.38(1H,d,J=2.0Hz,H8),6.18(1H,d,J=2.0Hz,H6),13C NMR(CD3OD) δ:148.0(C2),137.2(C3),177.3(C4),158.2(C5),99.2(C6),165.6(C7),94.4(C8),162.5(C9),104.5(C10),124.1(C1′),115.9(C2′),146.2(C3′),148.8(C4′),116.2(C5′),121.7(C6′);MSm/z:302,153,152,137,109,77。NMR得到的数据和文献上报道的槲皮素相一致,故可以判断该提取成分为槲皮素[3]。
4.HPLC测定 复方提取液中甘草苷成分的RPHPLC含量测定:分别精称甘草苷2.00 mg,置2 mL容量瓶中,加甲醇溶解,稀释至刻度,充分摇匀备用。色谱条件:方法色谱柱为HP hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈0.1%醋酸(20∶80),流速0.8 mL/min;检测波长为276 nm,柱温为25℃,进样体积10 μl[4]。流动相:甲醇0.5%乙酸铵溶液冰乙酸(67∶33∶1),检测波长:250 nm,进样量:10 μl,柱温:40℃。
(1)标准曲线的制备:用微量注射器分别吸取1.0,2.5,5.0.7.5,10μl的混合对照品溶液,进样测定。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标作图,得回归方程,相关系数,线性范围。甘草苷:Y=82.37X+2.15,r=0.9992,0～10 μg。
(2)精密度试验:精密吸取提取物的甲醇溶液,每次10 μl,连续进样7次,测定峰面积,计算甘草苷的含量。
(3)稳定性试验:分别在样品制备后的1,2,4,8,16 h吸取供试液,测定甘草苷的含量,RSD为2.27%(n=5)。
(4)回收率试验:称取甘草素对照品适量,加入到已知含量的甘草粉末中,按照对照品制备方法制备供试液,计算回收率(见表1)。外标两点测定法进行含量测定。
结果
复方松针水提取物浓缩后浸膏呈棕黄色,有机物萃取后萃取液淡黄色,呈油状,且具有辛辣气味。经色谱柱分离后的组分,组分Ⅰ 为白色粉末 易溶于乙酸乙酯,乙醚,经核磁进行表征是:(7S,8R)4,9′二羟3,3"二甲氧基7,8二氢苯并呋喃1′丙基木脂素9OβD吡喃葡萄糖苷。组分Ⅱ 为棕黄色不定型粉末,极易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚,但不溶于水,经核磁进行结构表征为:4(4′羟基苄基)2丁酮。组分Ⅲ为黄色粉末,核磁表征为:槲皮素。在甘草苷的HPLC的含量测定试验中,测得含量和直线方程分别为:1.89%(n=7),Y=82.37X+2.15,r=0.9992,0～10 μg。
讨论
本研究应用多种方法对复方松针提取物的化学结构和含量进行表征,可以较准确的反映主药成分的含量,为今后复方松针的质量控制提供理论依据,为建立不同批次的药物中的质量控制提供参考,此外,在复方松针提取液中,对其他各种挥发性成分的含量控制及含量测定,还有待完善,控制易挥发性成分的含量,有利于质量控制和保证制剂的药效,在今后的研究中,我们还应该注意质量控制指标的选择,综合考虑主药辅药的成分配比,根据每批次的药品和药材投料的实际情况,制定合理的含量限度或范围,从而保证每批次产品的稳定性,确保药效和安全性,在技术应用方面随着指纹图谱技术的引进,也为中药复方制剂的质量控制的稳定性提供了新的方法[6～7]。
参考文献
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[4]赵晓莉,崔小兵, 吴 皓.HPLC双波长法测定复方甘草合剂中甘草苷、甘草素及异甘草素的含量[J].中成药,2002,24(3):175-178.
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(收稿日期:2010-06-02 修回日期:2010-07-17)
(编辑:梁明佩)