橙皮苷改善肥胖小鼠糖脂代谢的机制研究
对照组、肥胖组、橙皮苷低剂量组及高剂量组，每组各10只。喂养16周后检测各组小鼠体重、肝指数、内脏脂肪指数，评价糖代谢状况（葡萄糖糖耐量、血糖、胰岛素水平及HOMA-IR）及血脂情况；Real-time PCR法检测肝脏胰岛素信号通路（IR，IRS1，Glut2，Glut4）、脂代谢途径（SREBP-1c，FAS，ACC，PPARα）关键基因及AMPK表达水平。经过16周喂养，肥胖组小鼠明显肥胖，体脂沉积显著（P<0.01），葡萄糖耐量降低（P<0.05）。血糖、血脂、胰岛素水平及HOMA-IR指数均高于对照组（P<0.05）。橙皮苷干预后，无论低剂量组还是高剂量组小鼠体重、血糖、血脂均较肥胖组明显降低（P<0.05），血清胰岛素水平及HOMA-IR亦显著下降（P<0.05）。其中大剂量组获益明显（P<0.05）。橙皮苷能够上调AMPK mRNA（P<0.05），继而影响胰岛素信号通路中IR，IRS1，Glut2/4的mRNA表达（P<0.05），同时降低脂代谢相关基因（SREBP-1c，FAS，ACC）的表达（P<0.05），并升高PPARα mRNA水平（P<0.05）。大剂量组变化尤为明显（P<0.05）。橙皮苷降低了肥胖、高血糖、高血脂，缓解了胰岛素抵抗，这一作用可能与其活化AMPK继而调控胰岛素信号通路及脂质代谢信号通路等密切相关。
[关键词] 橙皮苷；肥胖；糖脂代谢；胰岛素抵抗；AMPK
[Abstract] To explore the effects of hesperidin on glycolipid metabolic disorders and its mechanism in mice induced by high-fat diet， 40 male C57 mice were randomly divided into control group， OB group， low dose group （OB+ hes-low） and high dose group （OB+ hes-high） according to the diet. After 16 weeks， the body weight， liver index and visceral fat index in all mice were detected. The glucose metabolism indications （blood glucose， insulin levels and HOMA-IR） and serum lipid levels were evaluated. The mRNA expression of insulin signaling pathway genes（IR， IRS1， Glut2， Glut4）， lipid metabolism pathway genes（SREBP-1c， FAS， ACC， PPARα） and AMPK were analyzed by Real-time PCR. After 16-week feeding， the indicators in OB group were higher than those in control group， including body weight， body fat deposition， serum glucose， serum lipid， serum insulin and HOMA-IR index （P<0.05）. And impaired glucose tolerance occurred in the OB group （P<0.05）. Treating with hesperidin， whether in low or high dose， attenuated these changes （P<0.05）， especially in high dose group（P<0.05）. Hesperidin， especially in high dose， upregulated the mRNA expressions of AMPK （P<0.05）， which had impact on the gene expressions of insulin signaling pathway （IR， IRS-1， Glut2/4） （P<0.05） and lipid metabolism related genes （SREBP-1c and Fas and ACC） （P<0.05）. The activatory effect of hesperidin on the mRNA expressions of PPARα was also observed （P<0.05）， especially in high dose group （P<0.05）. Hesperidin inhibits obesity， hyperglycemia， hyperlipemia and attenuates insulin resistance. These effects might be closed related to the activation of AMPK， which regulate the insulin signaling pathway and lipid metabolism.
[Key words] hesperidin； obesity； glycolipid metabolism； insulin resistance； AMPK
doi：10.4268/cjcmm20161728
随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病发病率逐年上升。肥胖所导致的糖脂代谢紊乱是其重要原因。长期过量的营养摄入引起肥胖发生，继而出现能量代谢紊乱，脂质异位沉积，高血糖、胰岛素抵抗[1]。这几者之间相互作用，形成恶性循环，促进和加速动脉粥样硬化的发生发展[2]。因此改善肥胖所引起的糖脂代谢紊乱在心脑血管疾病的防治上具有重要意义。目前天然化合物因其来源广泛，药理作用多样，价格低廉等优点，已成为研究热点。
橙皮苷在药学上又称之为陈皮苷、桔皮苷，其是橙皮、柠檬中提取的一种苷类活性物质[3]。目前研究证实橙皮苷具有多种药理作用，包括抗炎症、抗氧化应激、降脂、软化血管、抗过敏等[4]。尽管已有研究表明其具有降脂及治疗糖尿病作用，但其具体机制不明。本研究拟采用高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型进行研究验证，并探讨其中机制。
1 材料
橙皮苷购于上海友思生物技术有限公司；血糖仪（OneTouch Ultra）及试纸由美国强生稳豪公司提供；小鼠胰岛素ELISA试剂盒由美国Linco公司提供；血脂试剂盒由北京利德曼试剂有限公司提供；反转录试剂盒购自北京天恩泽有限公司；SYBRGreen购于罗氏有限责任公司；其余试剂均购自国药集团，为分析纯级别。引物由上海生工合成。
2 方法
2.1 实验动物的分组及处理 雄性7周龄C57BL/6小鼠40只，购于重庆医科大学动物实验中心，合格证号SCXK（渝）2013-0001。所有小鼠先适应性喂养1周。而后根据随机数字表分为对照组（control）、肥胖组（OB）、低剂量组（OB+hes-low）及高剂量组（OB+hes-high），每组10只，体重22～24 g，各组间无统计学差异性。各组小鼠饲料配比如下：对照组给予普通饲料（能量比：12.4%脂肪，68.8%碳水化合物，18.8%蛋白质）；肥胖组给予高脂饲料（能量比：53.1%脂肪，26.4%碳水化合物，20.5%蛋白质）；低剂量组给予添加了含低剂量橙皮苷的高脂饲料（200 mg·kg-1小鼠体重），高剂量组给予添加了含高剂量橙皮苷的高脂饲料（400 mg·kg-1小鼠体重）。实验期间各组小鼠自由进食饮水，共干预16周。模型建立的评价参照文献[5]。
2.2 小鼠肝指数、脂肪指数的测定 小鼠处死前一晚禁食，次日称体重。乙醚麻醉后经颈椎脱臼法处死，迅速分离肝脏，称重计算肝指数，肝指数=肝重/体重×100%。取部分肝脏组织液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用。取内脏脂肪组织称重记录，包括腹膜后、肠系膜、附睾旁脂肪组织。内脏脂肪指数=内脏脂肪重/体重×100%。
2.3 小鼠经腹葡萄糖耐量测定 小鼠处死前3 d行经腹葡萄糖耐量实验。实验前小鼠隔夜禁食至少8 h，于0 min经鼠尾行血糖检测，血糖值记为G0。后腹腔给予20%葡萄糖注射（2 g·kg-1小鼠体重）。给药后15，30，60，120 min 后检测血糖，分别记为G15，G30，G60，G120。根据检测结果绘制葡萄糖耐量曲线图，并计算曲线下面积（AUC）。计算公式如下：AUC（mmol·min·L-1） = （G0+G15）×15/2+（G15+G30）×15/2 + （G30+G60）×30/2+（G60+G120）×120/2。
2.4 血清胰岛素测量及稳态模型的胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）计算 实验前小鼠空腹至少8 h，经鼠尾测空腹血糖。使用采血管经眶后静脉丛收集血液约300 μL，4 ℃，2 000 r·min-1离心取上清，-80 ℃冻存，用于胰岛素水平的检测。胰岛素检测采用ELISA法，根据试剂盒说明书进行。HOMA-IR根据血糖及血清胰岛素值计算：HOMA-IR=胰岛素水平（mIU·L-1）× 空腹血糖水平（mmol·L-1）/ 22.5。
2.5 血脂检测 实验结束时，眶后静脉丛取血，4 ℃，2 000 r·min-1离心，分离上清冻存于-40 ℃冰箱中；全自动生化分析仪测高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总甘油三酯（TG）、总胆同醇（TC）。
2.6 Real-time PCR检测肝脏胰岛素信号通路及炎症与关键基因 取出-80 ℃冰箱冻存的肝脏组织，冰上匀浆，用Trizol reagent试剂盒提取肝脏总RNA，逆转录获得cDNA。引物序列见表1。荧光定量PCR进行扩增，按照两步法 SYBR Real-time PCR Kit（Roche）试剂盒说明书配制反应体系；温度循环参数为预变性95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环进行PCR扩增反应。每个样本设置3个复孔，取其平均值，每组6个样本进行统计分析。最终结果设定以对照组为基线设为1，其余各组以倍数表示。
2.7 数据处理与统计分析 所有数据用SPSS 13.0软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。
3 结果
3.1 各组小鼠一般情况比较 经过16周的高脂饮食诱导，肥胖组小鼠成模率达100%，主要表现为体重显著增加，肝脏指数上升，内脏脂肪增多，脂肪指数增加（P<0.01）。长期食用橙皮苷的小鼠，无论高、低剂量组体重、肝指数及内脏脂肪增加均明显缓慢（P<0.05），不过2组间未显现出差异性，而小鼠摄食量改变不大，见表2。
3.2 橙皮苷改善了小鼠葡萄糖耐量 糖耐量试验是评价糖代谢的重要指标。对照组小鼠血糖高峰值在腹腔给糖后15 min出现，其后逐渐降低，120 min后逐渐恢复正常。其曲线下面积也偏小；肥胖组小鼠的血糖最高峰明显后移至30 min，高血糖持续时间长（P<0.01），下降缓慢，2 h后仍未恢复至正常水平（P<0.01），整个曲线下面积较大（P<0.01）；橙皮苷干预后，无论高、低剂量组各时间点血糖值及AUC面积均低于对照组（P<0.05），高剂量组尤为明显（P<0.05），见图1。
3.3 橙皮苷降低了小鼠的空腹血糖、血清胰岛素水平及HOMA-IR指数 长期的高脂饮食导致肥胖组小鼠血糖升高（P<0.01），同时伴发高胰岛素血症（P<0.05），HOMA-IR亦明显增高（P<0.01），存在胰岛素抵抗；而长期的橙皮苷干预缓解了胰岛素抵抗状况，无论低剂量组还是高剂量组小鼠血糖、血清胰岛素水平及HOMA-IR指数均有了不同程度的降低（P<0.05）。其中高剂量组在血清胰岛素水平及HOMA-IR指数上显现出更多获益（P<0.05），而对空腹血糖影响不大，见表3。
3.4 橙皮苷降低了高脂血症 长期的高脂饮食诱导小鼠形成了明显的高脂血症，各项血脂指标均显著升高（P<0.05），橙皮苷干预后，各项血脂指标均明显下降（P<0.01），其中高剂量组显示出更强的降脂效果（P<0.05），但对TG影响不大，见表4。
3.5 橙皮苷对糖脂代谢关键基因的调控 本实验检测了肝脏组织中糖脂代谢关键基因mRNA的表达水平。长期高脂饮食使胰岛素信号关键基因IR，IRS1 mRNA表达分别下调了78%，67%（P<0.01）；有关葡萄糖转运相关的Glut2（主要在肝脏表达，负责葡萄糖转运）及Glut4 mRNA（在肝脏少量表达，负责胰岛素增高条件下葡萄糖摄入的迅速增加）表达分别下调了68%，58%（P<0.01）；脂代谢相关基因SREBP-1c，FAS，ACC则分别上升了408%，465%，162%（P<0.01）；PPARα mRNA下降了69%（P<0.01）；同样，作为所有糖脂代谢关键基因的枢纽AMPK表达亦变化明显，高脂饮食使其显著下降（P<0.01）；橙皮苷干预后，无论高、低剂量组均有效地改善了上述关键基因的表达，提高了糖脂代谢能力（P<0.05）；其中高剂量组在各关键基因的调控变化上均较低剂量组明显（P<0.05），见表5。
4 讨论
糖脂代谢紊乱是心血管疾病的基础及高危因素[6]。肝脏作为机体最重要的能量代谢器官，在其发病机制中占有重要地位。当肝脏中脂肪酸和甘油三酯的合成、装配、修饰、转运、分解等多途径受到任何干扰时，脂质都有可能沉积在肝脏中，进而形成脂肪肝。长期脂质沉积可致脂毒性激活炎症因子和产生胰岛素抵抗。这几者相互作用形成恶性循环，持续加重并损害机体能量代谢[7]。本研究显示，在橙皮苷的长期干预下，无论低剂量组还是高剂量组，均降低了体重，减轻了高脂血症，减少了脂质沉积，缓解了胰岛素抵抗，其中大剂量显现出更多获益。
为了阐明其中的分子机制，本研究检测了脂代谢途径及糖代谢相关通路上关键基因的表达，并检测了作为两者枢纽的关键上游基因AMPK。AMPK是一种重要的蛋白激酶，调节者细胞和机体的能量代谢，也是重要的糖脂代谢的上游影响因子[8]。活化的AMPK能磷酸化下游分子信号，可增加能量的分解代谢（如脂肪酸氧化代谢）又可关闭合成代谢（如脂质的从头合成途径）。同时也影响着靶器官对葡萄糖的利用、胰岛素的敏感性、机体炎症因子的转录等[9]。研究已证实AMPK可以和胰岛素受体底物1 （IRS-1）在Ser-789位点磷酸化，增加IRS1表达，进而改善胰岛素敏感性[10]。同时AMPK亦可通过磷酸化丝氨酸-79、丝氨酸-1200以及丝氨酸-1215127来改变ACC表达，还能影响FAS的转录后调控，进而影响脂质合成及氧化代谢[11]。笔者认为橙皮苷可以通过以下2条途径改善糖脂代谢紊乱。①脂代谢方面：SERBP-1c，FAS，ACC与脂肪酸、甘油三酯的合成密切相关[12-13]，PPARα则参与脂肪酸β氧化，促进脂肪分解[14]，持续的高脂饲料诱导了脂质合成的转录因子持续高表达，而使得PPARα表达下降，橙皮苷通过激活AMPK进而降低ACC及FAS活性，减少脂质合成；②糖代谢方面，IR-IRS1及其下游的Glut2/4是其重要的调节元件。高脂饮食使得IR，IRS1表达显著下调，胰岛素敏感性降低，血糖升高。同时由于脂质异位沉积、慢性炎症刺激、氧化应激等因素持续存在时，GLUT2的表达和功能受影响，肝脏葡萄糖利用不足和释放过度[15]。并且GLUT4表达相应减少，葡萄糖转运能力下降，反馈使得胰岛素分泌增加，加重胰岛素抵抗[16]。因此肥胖组小鼠表现出高血糖、高胰岛素血症及升高的HOMA指数。橙皮苷通过上调AMPK使得IRS1活性增加，增加了胰岛素敏感性，进而激活Glut2/4，加强葡萄糖转运继而降低了血清葡萄糖。在整个过程中，大剂量的橙皮苷因能够更多的激活AMPK，故显现出更多获益。
综上所述，本研究显示橙皮苷能够很好地改善高脂饮食所诱导的糖脂代谢紊乱，这一作用主要表现为减少体脂沉积、减轻高脂血症、降低血糖及胰岛素水平，抑制胰岛素抵抗发生。这些效应可能与其活化AMPK继而调控胰岛素信号通路及脂质代谢信号通路等密切相关。
[参考文献]
[1] Burgi A C， Dufour J F. Treatment of nonalcoholic steatohepatitis[J]. Rev Prat， 2012， 62（10）：1425.
[2] Lovren F， Teoh H， Verma S. Obesity and atherosclerosis： mechanistic insights[J]. Can J Cardiol， 2015，31（2）：177.
[3] Roohbakhsh A， Parhiz H， Soltani F， et al. Molecular mechanisms behind the biological effects of hesperidin and hesperetin for the prevention of cancer and cardiovascular diseases[J]. Life Sci， 2015，124：64.
[4] 刘学仁，张莹，林志群. 橙皮苷和橙皮素生物活性的研究进展[J]. 中国新药杂志，2011，20（4）：329.
[5] Pu P， Wang X A， Salim M， et al. Baicalein， a natural product， selectively activating AMPKalpha（2） and ameliorates metabolic disorder in diet-induced mice[J]. Mol Cell Endocrinol， 2012， 362（1/2）：128.
[6] Lim S， Meigs J B. Links between ectopic fat and vascular disease in humans[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2014，34（9）：1820.
[7] Dietrich P， Hellerbrand C. Non-alcoholic fatty liver disease， obesity and the metabolic syndrome[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol， 2014， 28（4）：637.
[8] Qi D， Young L H. AMPK： energy sensor and survival mechanism in the ischemic heart[J]. Trends Endocrinol Metab， 2015，26（8）：422.
[9] García-Prieto C F， Gil-Ortega M， Aránguez I， et al. Vascular AMPK as an attractive target in the treatment of vascular complications of obesity[J]. Vascul Pharmacol， 2015，67/69：10.
[10] Hjlund K. Metabolism and insulin signaling in common metabolic disorders and inherited insulin resistance[J]. Dan Med J，2014，61（7）：B4890.
[11] Wang S， Moustaid-Moussa N， Chen L， et al. Novel insights of dietary polyphenols and obesity[J]. J Nutr Biochem， 2014，25（1）：1.
[12] Paneni F， Costantino S， Cosentino F. Insulin resistance， diabetes， and cardiovascular risk[J]. Curr Atheroscler Rep， 2014， 16（7）：419.
[13] Al-Goblan A S， Al-Alfi M A， Khan M Z. Mechanism linking diabetes mellitus and obesity[J]. Diabetes Metab Syndr Obes， 2014， 7：587.
[14] Pawlak M， Lefebvre P， Staels B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism， inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol， 2015， 62（3）：720.
[15] Leturque A， Brot-Laroche E， Le Gall M. GLUT2 mutations， translocation， and receptor function in diet sugar managing[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2009， 296（5）：E985.
[16] Watson R T， Pessin J E. Intracellular organization of insulin signaling and GLUT4 translocation[J]. Recent Prog Horm Res， 2001， 56：175.
[责任编辑 马超一]