茜草提取物对大强度耐力训练大鼠心肌线粒体抗氧化能力、ＡＴＰ酶活性影响的实验研究
摘要：目的：探讨茜草提取物对大强度耐力训练大鼠心肌线粒体抗氧化能力以及ATP酶活性的影响，为茜草作为运动补剂的开发提供试验依据。方法：通过建立大强度耐力训练大鼠模型，测定心肌线粒体ATP酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活性以及过氧化氢(H202)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，研究茜草提取物对大强度耐力训练大鼠心肌线粒体的保护作用。结果表明，茜草提取物可明显提高大鼠心肌线粒体在大强度耐力运动中的能量供给、抗氧化能力，防止心肌线粒体的氧化损伤，保证了运动中心脏的正常生理功能。
关键词：茜草提取物；心肌线粒体；运动能力
中图分类号：G804．7 文献标识码：A 文章编号：1007—3612(2006)09—1211—03
茜草(Rubia Cordifolia，L)，俗名血见愁、活血草、地血等，我国大部分地区均有分布，其性味苦寒，归肝经，具有凉血止血、通经活络、止咳祛痰等功效，主治蛆血、崩漏下血、外伤出血、收缩平滑肌、扩张血管、降低血压、关节痹痛、跌扑肿痛等。茜草中主要含有水溶性的环已肽类系列物质、脂溶性成分蒽醌及其糖苷、还有萘醌及其糖苷，此外还含有萜类，β－谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素。现代药理研究表明，茜草提取物具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集等作用。茜草提取物对运动过程中自由基的清除效果、心肌细胞损伤的保护作用的报道尚少。本实验从亚细胞器水平来探讨茜草提取物的抗氧化作用，以及茜草提取物对大强度耐力训练大鼠线粒体内ATP酶活性的影响，为中药抗运动疲劳的开发提供实验依据。
1 实验方法
1．1实验材料茜草为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L的干燥根，购于宁波市中药制药厂，经中药实验室鉴定为正品；茜草提取物由宁波市中药制药厂提供，提取工艺参照谭朝阳等和孟宪元等方法进行醇－水提。醇提的有效成分是蒽醌及其肽类、萘醌类、萜类，其中包括茜草双酯和茜草素等有效成分；水提的有效成分主要是茜草多糖和环已肽类系列物质。
1．2实验动物及分组 本实验选用SD雄性大鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，体重180～220 g，共24只。将大鼠随机分为3组：安静对照组，大强度耐力训练组(训练组)，大强度耐力训练+茜草组(训练加药组)，每组8只。各组每天自由摄食饮水，同时训练加药组每天灌胃2 mL茜草提取物的生理盐水溶液(500 mg／kg)，安静组和训练组灌胃同体积的生理盐水，实验共6周。
1．3实验方案 实验动物正式实验前，在国产跑台上作5rain的适应性训练(速度8．2 m／min坡度为0)，正式实验时，训练组和训练加药组大鼠采用Benford根据大鼠体重／摄氧量回归方程建立递增负荷跑台运动疲劳模型，训练持续6周，每周6 d，周日休息。先进行1周适应性训练，逐渐提高运动强度至80％VO2max以上，最后一天训练至力竭。运动时用声光刺激或者用毛刷刺激动物尾部，使动物保持在跑台前部1／3处，以保证运动强度。具体实验方案见下表：
3 分析与讨论
3．1茜草提取物对大强度耐力训练大鼠心肌线粒体抗氧化能力影响的机制探讨 自20世纪60年代以来，人们一直对线粒体与运动的关系密切关注，有关运动与线粒体抗氧化能力变化的研究已取得了不少有价值的成果。有研究表明，运动可导致体内脂质过氧化物水平增高，作为脂质过氧化物的一种，MDA可反映体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞的损伤程度。大鼠长时间力竭游泳后，心肌线粒体MDA含量增加，抗氧化酶活性下降，表明长时间力竭运动会导致机体内源性自由基增加，使心肌线粒体膜脂双层发生脂质过氧化反应，丙二醛的含量增加。丁树哲等以耗竭性跑步和耗竭性游泳的大鼠为急性运动模型，观察了心肌线粒体膜的脂质过氧化水平，发现运动后心肌线粒体膜脂质过氧化水平明显高于对照组。Somani SM等以Fisher－344大鼠急性运动为模型观察了心肌线粒体GSH—Px活性的改变，结果发现，急性运动后心肌线粒体GSH—Px活性增高129％。有关运动后心肌SOD活性改变的报道已有很多，但有关运动后心肌线粒体SOD活性变化的报道并不多见。张钧等以大鼠力竭运动为模型，观察了运动后心肌线粒体SOD活性的变化情况，发现力竭运动后即刻SOD活性明显下降，而Somani SM等发现Fisher－344大鼠力竭运动后心肌线粒体SOD酶活性增加了167％。
本试验的结果表明，长时间大强度力竭性运动可以导致心肌线粒体抗氧化酶(Mn—SOD、GSH—Px、CAT)活性显著下降，心肌线粒体内H2O2和脂质过氧化产物MDA含量显著增加，提示长时间大强度力竭性运动可使心肌线粒体内自由基增多，尤其是H2O2和大量堆积，SOD也随之被大量利用以催化的歧化反应。另外，由于心脏处于严重的缺血、缺氧状态，心肌细胞自由基增加，出现心肌细胞和心肌线粒体钙超载，并发生缺血、缺氧性损伤，导致心肌细胞与间质胶原间正常比例遭到破坏，使心脏自身的防御系统不能有效的发挥作用，造成心脏有生理性向病理性转变，导致心肌损伤。由于H2O2，可作为金属辅基的还原剂，从而抑制SOD、GSH—Px、CAT等酶的活性。研究发现，当H2O2浓度增大时，红细胞SOD的β-折叠含量减少，无规则卷曲含量增加。这说明活性氧可使SOD的β－折叠向无规则卷曲转变，即对该酶的二级结构产生影响，从而导致酶活下降。所以当机体中的H2O2，浓度增加到一定程度时，会抑制抗氧化酶的活性，推测此时抗氧化酶的活性下降可能是由于产物浓度的堆积，从而抑制了酶催化此反应的能力而造成的。训练组大鼠心肌线粒体MDA含量的升高，也说明了心肌线粒体内的自由基大量增生，抗氧化物质和抗氧化酶大量消耗，致使自由基代谢失衡，心组织的氧化损伤加剧。
训练加药组较训练组大鼠心肌线粒体抗氧化酶(Mn—SOD、GSH—Px、CAT)活性显著升高，心肌线粒体内H2O2，和脂质过氧化产物MDA含量显著下降。说明茜草提取物能保护抗氧化酶的活性，抑制大强度力竭性运动造成的心肌线粒体氧化损伤。其机制可能是：1)茜草提取物中富含茜草多糖、茜草双酯和茜草素等抗氧化成分，可直接中和自由基，特别是抑制了H2O2，的大量堆积，使Mn2+－SOD、GSH—Px、CAT等消
耗减少，活力上升，心肌线粒体内自由基代谢达到了新的平衡；2)茜草提取物中可能具有刺激抗氧化酶活性的组分，使其活力增加。3)茜草中某些成分能诱导运动中内源性抗氧化酶的基因表达，使酶活性升高。
3．2茜草提取物对大强度耐力训练大鼠心肌线粒体ATPase影响的机制探讨 ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用。机体在缺氧或病理状态下，ATP酶活力发生一系列转变，所以ATP酶活力的大小是各种细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。在生物体内，90％以上的氧分子在线粒体中被消耗，从生物氧化反应的分子过程看，氧作为一种必需物质具有益害两重性，～方面，氧作为呼吸链的终端电子受体参与产生ATP的氧化磷酸化反应，是维持生命的重要能量代谢过程；另一方面，氧可通过一系列化学反应生成有害的氧自由基，造成细胞损伤并导致疾病和衰老。长时间运动后，线粒体内会产生大量的自由基、过氧化物，线粒体内ca2+的大量积聚，超出其缓冲能力，可引起线粒体结构损伤、功能下降，抑制线粒体氧化磷酸化，造成ATP供给障碍等。
线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶位于线粒体内膜中，两者在维持线粒体容量、线粒体膜内外离子平衡、渗透压平衡方面起关键作用，是线粒体结构、功能变化的灵敏指标。在本实验中训练组心肌线粒体Na2+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性都显著降低(p<0．01)，其可能的机制为：长时间的力竭性运动使心肌线粒体内自由基产生增加，一方面自由基直接作用于酶上的活性基团，引起基团结构变化，导致酶活性的改变；另一方面，自由基作用于酶蛋白周围的脂类，引起这些脂类过氧化，使酶活性发生改变。其中Na+-K+-ATP酶活性的下降使膜内Na+不能外排，线粒体Na+潴留，减少Na+-ca2+交换，同时水钠潴留使线粒体肿胀甚至破裂，细胞线粒体受损，影响其功能。
本试验的结果表明，茜草提取物能提高大强度耐力训练大鼠心肌线粒体内Na+-K2+-ATPase和ca2+-ATPase的活性，提示其具有线粒体保护作用。其可能的机制为：1)茜草提取物中富含抗氧化成分，可直接清除运动中产生的自由基，来保护线粒体膜结构的完整性，保护其ATP酶的活性。2)茜草提取物可能含有增强自由基的防御体系的活性成分。3)抑制线粒体膜上ATP酶活性的下降和线粒体钙的升高。4)茜草中可能具有激活线粒体酶活性的有效成分，且对线粒体呼吸链酶复合体I+Ⅲ敏感，保护其传递功能。4)茜草多糖能通过抗氧化作用及提高防御系统功来保护线粒体免受自由基的损伤，其具体机制有待于进一步研究。
4 小 结
1)茜草提取物可以提高大鼠Mn—SOD、GSH—Px、CAT活性，降低MDA和H10，的含量，说明对消除运动产生的自由基和提高机体的抗氧化能力有积极的作用；2)茜草提取物能提高大强度耐力训练大鼠心肌线粒体内Na+－K+－ATPase和ca2+－ATPase的活性，提示其具有线粒体保护作用。
以上针对补充茜草提取物对大强度耐力训练大鼠心肌线粒体抗氧化能力以及ATP酶活性的影响，证明了茜草抗自由基氧化、阻止膜的脂质过氧化和保护心肌线粒体结构完整的显著作用。但是由于目前国内外关于报道茜草提取物的研究较少，故我们从两个角度初步探讨了茜草对大强度耐力训练后一次力竭大鼠的影响，然而对于其他形式的运动其抗氧化能力如何?茜草提高心肌线粒体抗氧化酶活性和ATP酶活性的分子生物学机制等还有待于进～步的深入研究。
注：“本文中所涉及的表格、注解、公式等请以PDF格式阅读原文。”