基于纳米银催化银沉积的核酸适配体传感器研究

时间：2022-11-19 18:35:07 来源：正远范文网 本文已影响人

学生物传感器等[2-4]。将电化学检测的优点和核酸适配体特异性的识别能力结合起来并应用在传感器中，已经成为当前研究的重点。丝网印刷芯片电极由于具有其他电极所没有的独特优点，具有成本低，灵敏度高、重现性好、可一次性使用的优点，为医学诊断提供一个崭新的分析平台。在各种纳米材料标记物中，纳米银颗粒因为更容易氧化，因而具有更好的电化学性活性，从而更适合作为检测探针。本研究以多孔板为分析平台，丝网印刷芯片电极为检测装置，构建电化学核酸适配体传感器。将生物素修饰的核酸适配体固定至链霉亲和素包裹的多孔板中，以巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为探针。通过三明治型的夹心反应后，加入银增强溶液，利用纳米银催化效应，在孔板中形成了大量的银沉积物。随着酸溶液溶解生成的银沉积物，采用方波阳极溶出伏安法对释放出的银离子进行测定，从而实现对PDGF-BB定量测定。

1 试剂和仪器

链霉亲和素（北京博奥生物有限公司）；PDGF-BB（MW= 24800 Da，R&D System，Minneapolis）；牛血清白蛋白，硝酸银，硼氢化钠，吐温（Tween-20），KCI，MgC12，抗坏血酸（Sigma-Aldrich，美国）。H2S04，HNO3，KNO3，NaCI，Na2HP04，KH2P04（南京化学试剂有限公司）；96孔板（上海生工生物有限公司）。丝网印刷芯片电极为实验室自制，所用水均为超纯水。CⅢ1232B便携式电化学工作站（上海辰华）。

实验中所需缓冲溶液如下：1×PBS （137mM NaCI，2.7mM KCI， 10mM Na2HP04，2mM KH2P04，pH=7.4）；1×PBSM（1×PBS，1 mM MgCl2）； PBST（1×PBS， 5%Tween-20）：商品化的无蛋白封闭缓冲溶液（Tris缓冲溶液做溶剂，pH=7.4）；碳酸钠缓冲溶液（pH=9.6）。

所用核酸适配体如下：

5 ’ AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5’端由巯基修饰（巯基修饰的核酸适配体）。

5’-AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5’端由生物素修饰（生物素修饰的核酸适配体）。

2 实验过程

2.1巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银制备

在搅拌的状态下将硝酸银和硼氢化钠（体积比为1：3）逐滴加入冰浴中并混匀，持续搅拌直至恢复至室温。为制备核酸适配体功能化的纳米银，将100μL浓度为IOμM的巯基修饰的核酸适配体与1 mL所合成的纳米银混合。将上述溶液用盐溶液进行陈化，分次加入NaCI直至浓度为0.2 M。孵育42 h后，用1×PBS缓冲溶液离心洗涤3次，最终分散至1×PBSM缓冲溶液中。巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银不用的时候，于4℃下保存。

2.2多孔板中分析PDGF-BB过程

将100μL浓度为5 mg/mL的链霉亲和素（用碳酸钠缓冲溶液溶解，pH=9.6）加入到96孔板中，4℃孵育并静置过夜。各孔用100 μL无蛋白封闭缓冲溶液于37℃下温育1h以消除非特异性的吸附，并用PBST缓冲溶液清洗3次。随后往各孔中加入200μL浓度为200nM的生物素修饰的核酸适配体（1XPBS缓冲溶液），37℃下反应1h后用PBST缓冲溶液清洗3次。在各反应孔中加入不同浓度的PDGF-BB（1×PBSM缓冲溶液），于37℃下反应th后用PBST缓冲溶液清洗3次，以去除未结合的PDGF-BB。最后，在各孔里添加100μL巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银，37℃下反应1h，在孔中形成了生物素修饰的核酸适配体，PDGF-BB，巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银这三者之间的三明治型的复合物。各孔用PBST缓冲溶液洗涤3次后待用。

将0.4 mmol/L硝酸银和0.2 mmol/L抗坏血酸混合液（体积比为1：1）加入反应后的各孔中，并在暗处避光放置10 min。银沉积反应完成后，用水清洗各孔3次，排干后各孔加入100 μL浓度为l mol/L的HNO3，于室温下溶解所生成的银沉积物。

完成反应后的各孔里加入100μL浓度為1M的KNO3，混匀后将丝网印刷芯片电极插入孔中，并连接电化学工作站，用方波阳极溶出伏安法测定溶液中的银离子。电极在一0.5 V下，富集10 min后在- 0.4～+ 0.4 V进行方波伏安扫描，记录峰电流。峰电流的浓度的对数与PDGF-BB的浓度线性相关，从而实现定量测定。

3 结果与讨论

3.1检测原理

本研究提出的基于纳米银催化银沉积的多孔板电化学核酸适配体传感器测定PDGF-BB的示意如图1所示。首先利用聚苯乙烯的吸附作用，在pH=9.6的碳酸钠缓冲溶液里，将链霉亲和素包被在多孔板中。5’端生物素修饰的核酸适配体加入后，通过生物素-亲和素之间的特异性结合，可将适配体固定至孔板表面。5’端巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为检测探针。传感器的检测模式采取三明治型的夹心法，PDGF-BB有两个活性点位可以与适配体结合，因此，在孔板中可形成生物素修饰的核酸适配体，PDGF-BB，巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银这三者之间的三明治型的复合物。探针中的纳米银具有较好的催化活性，可以催化抗坏血酸还原硝酸银的反应，从而在孔内形成大量银的沉积物。用HNO3将沉積的银溶解，并于体系内释放出大量的银离子。将丝网印刷芯片电极插入到孔板内，连接便携式电化学工作站和计算机，采用方波阳极溶出伏安法，可定量测定出反应体系所生成的银的量，实现了对PDGF-BB的定量测定。

3.2分析性能

采用标准曲线法，对不同浓度的PDGF-BB进行定量分析。PDGF-BB的含量和纳米银催化银沉积反应所生成的银的溶出峰电流值相关，同预期一致，银的溶出峰电流值随着PDGF-BB的浓度增加而增加（见图2A）。传感器的标准曲线如图2B所示，从图中可知，峰电流值和PDGF-BB浓度的对数值线性相关，线性范围为3.12-200 ng/mL。标准曲线的线性方程为，（uA）= 3.965-1.39 log C（ng/mL），其中C是PDGF-BB的浓度，堤传感器银的溶出峰峰电流值，线性相关系数R=0.976 4。在3倍信噪比下，计算出传感器的检出限为1.23 ng/mL。该检出限适用于医疗诊断中微量PDGF-BB的测定。

为考察传感器的特异性，以PDGF的两个异构体（PDGF-AB，PDGF-AA），BSA，凝血酶（Thrombin）作为可能存在的干扰物质，分别对浓度为50 ng/mL的PDGF-BB，PDGF-AB，PDGF-AA，Thrombin，以及浓度为1mg/mL的BSA进行定量分析。由结果可知，仅当有PDGF-BB存在时，才有传感器的电流响应，PDGF-AB，PDGF-AA和Thrombin的响应值与BSA相近，结果表明，本研究所提出的基于纳米银催化银沉积的多孔板电化学核酸适配体传感器的特异性良好。

4 结语

本研究以酶标板为分析平台，丝网印刷芯片电极为检测装置，构建电化学核酸适配体传感器。将生物素修饰的核酸适配体固定至链霉亲和素包裹的酶标板中，以巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为探针，实现对PDGF-BB的定量测定。分析方法测定结果良好，特异性佳。

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