荧光标记技术的研究进展分析
【摘 要】荧光标记技术是把荧光基团的共价键连接到蛋白、核酸等能够识别分子物质上的一种技术。这种技术通过了荧光的信号物质的特定基团，与识别分子物质的特定基团反应，从而完成其标记过程，利用标记物的荧光特性，来提供被检测对象的信号。荧光标记方法具有如无放射性、操作简单、高灵敏度和较好选择性等优点。荧光标记物种类多、标记方法灵活，可应用于多种生物大分子以及药物的检测。
【关键词】荧光标记技术；荧光标记物；荧光素
中图分类号： Q78 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）25-0085-002
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.25.037
【Abstract】Fluorescent labeling is the process to connect the fluorescent group to the recognition molecules such as proteins and nucleic acids.Based on fluorescent properties of fluorescent-labeled recognition molecules，the targeted molecules can be deteminated.This method has advatanges such as non-radioactive，easy operation，high stability，high sensitivity and high selectivity，and widely applied to detect a variety of biological macromolecules and drugs.
【Key words】Fluorescence labeling technique；Fluorescent marker；Fluorescein
荧光标记技术，也就是利用一些能够发荧光的物质，再利用共价键结合在了所要研究的分子的某一个基团之上，然后再利用它的荧光特性，来提供给被研究的对象信息的一种技术。荧光标记技术起源自20世纪40年代，当时使用荧光标记抗体来检测相应的一些抗原。随着分子生物学、现代医学的发展以及各种先进荧光检测技术及仪器的应用，荧光标记作为一种新的、非放射性的标记技术受到人们很高的重视，并取得了极为迅速的发展，继而广泛应用在了细胞内外的物质检测、核酸的检测与疾病早期的诊断等，在生物学研究领域以及医学研究领域里发挥了重要的作用。
1 荧光标记技术的原理
荧光，又叫做“萤光”，是指一种光致的发光现象。当某些常温的物质经过某种波长入射光的照射之后，吸收光能将跃迁到激发态，然后通过振动弛豫、内转化等现象达到第一激发态，随即在激发态停留大约10-8S之后，能够跃迁至基态，常常伴有随光的辐射，这里发出的光也就是荧光。利用荧光标记分子，将其共价结合在一些分子识别物质（比如酶、抗原/抗体、DNA、适配体、多肽等）上作为探针，分子识别物质与被检测的对象（比如蛋白、多肽等）进行反应之后，根据荧光标记分子在反应前后的荧光强度变化，对被检测对象进行各种定量的分析。
2 荧光标记物
荧光标记试剂也就是提供荧光体的试剂。在荧光标记的技术中，最常用的试剂有罗丹明类和荧光素类等，其它的荧光标记试剂，还有多环芳烃的化合物、芳香杂环的化合物类以及一些稀土元素的螯合物等，近期发展起来的某些新型的荧光标记试剂，同样也受到很大程度的重视。
2.1 荧光素类
荧光素类的标记试剂，包括有标准荧光素及其衍生物。例如荧光素类的衍生物，有荧光素异硫氰酸、四氯荧光素、羟基荧光素等。其中FITC是應用最为广泛的一种荧光素的衍生物，它广泛应用于杂交的探针、降解蛋白质的测序以及抗体标记中。FAM、TET 等荧光素衍生物，主要在标记技术当中，应用于核酸探针和DNA的自动测序等。荧光素类标记试剂的主要结构之中，因为苯环上有比较大的羧基，使得芳香环保持于和生色团垂直的一个位置，使得荧光量子的产率有所提高。但是荧光素类衍生物有也存在一些共同的缺点：比如pH 的敏感性较强、光淬灭率较高、发射波谱较宽等。
2.2 罗丹明类
罗丹明类的标记试剂，也是标准荧光素的衍生物之一，主要包括有R101、四乙基罗丹明、羧基四甲基罗丹明等。罗丹明类试剂的主要结构中R2、R3均为活性基团，主要是—NCS、—SO2X 等基团。在标记反应当中，活性基团大多将与—NH2结合。与荧光素类的衍生物相比而言，罗丹明类的荧光素光稳定性更强、荧光的产量更高，而且pH 敏感性更低。
2.3 其它荧光标记试剂
还有一些荧光标记试剂包括：多环芳烃吲哚、萘、蒽、芘等，芳香杂环化合物吖啶、香豆素、菲锭类等，镧系稀土的螯合物，藻红素N、哌洛宁、色霉素A3等。其中吲哚、哌洛宁、色霉素A3主要就是用来标记生物核酸。
2.4 新型荧光试剂
以上传统的荧光试剂一直以来应用很广，但也存在着或多或少的缺陷，比如光漂白现象（可能导致了荧光的信号不稳定）。另外，传统生物分子的荧光标记法，只能连接少数几个荧光分子于生物分子的活性基团之上，分析的灵敏度很有限。近年来，纳米级荧光探针的问世，为生物标记打开了新的发展领域。纳米荧光具有（1）激发的光谱宽，（2）连续的分布，（3）发射光谱分布对称而且宽度窄，（4）颜色可调节等优点。
3 荧光标记分析方法
荧光标记分析法，即一种生物的分析方法，它以荧光物质作为标记物。根据所使用的一些分子的识别物质（比如酶、抗原/抗体、DNA、适配体、多肽等）的不同，可以分为荧光免疫的分析法、基于DNA杂交的荧光分析方法、基于适配体的荧光分析法、基于多肽的荧光分析法等。
3.1 荧光免疫分析法
用荧光的生成试剂，或者是具有强荧光的试剂来作为标记物，进行免疫分析，称之为荧光免疫的分析法。熒光免疫分析法有他独特的优点：灵敏度较高，线性范围也较宽，便于均相的测定等。但是，由于有机的荧光标记物的激发光谱以及发射光的谱斯托克位移比较小，在检测发射光之时均会受到激发光的一些干扰。另外，还有很多有机的荧光化合物的激发波长也较短，使得一些共存物、体液之类产生了较强的自发背景的荧光。这些原因都将导致了荧光免疫的分析法，背景普遍较高，从而限制了它灵敏度的提高。
3.2 基于DNA杂交的荧光分析法
基于DNA杂交的荧光分析法，是DNA 检测技术之中，最常用的一种检测方法。在DNA的靶序列上先标记上荧光的染料，然后将它与DNA探针进行杂交，通过荧光扫描仪或激光扫描共焦显微镜就可获取荧光的杂交信号。这种方法成熟稳定，但是实验使用的扫描仪器比较昂贵，所以成本较高，并且荧光在空气中很容易被猝灭。Bier等[1]用花青的二聚体YOYO以及Picogreen，作为与DNA双链紧密结合的一种荧光“嵌入剂”，由于和DNA杂交体之间的这种“双嵌”入作用，使得配对完全、可以错配单碱基、两个以上不匹配而产生的荧光信号有着明显的不同，从而能够明显的区分出不同的DNA序列，对于目的基因的检出限，达到了300pg/mL，循环再生经过60次以后，仍能保持很好的灵敏度。
3.3 基于适配体的荧光分析法
适配体是指，经过体外的指数富集，从而筛选出来的一类具有着高度的亲合力、高度的特异性可以结合其他分子的一些DNA或RNA的分子。适配体的荧光探针，是把荧光分子标记在了适配体之上，从而构成的一种新型的探针。报道的适配体的荧光探针，主要包括有——单荧光修饰型和双荧光修饰型[2]。单荧光修饰型的适配体荧光探针，是将单个的荧光基团，适当进行共价修饰后，将适配体直接当做了示踪的分子，然后以荧光的强度、荧光的寿命、荧光的各向异性值等为衡量指标，对目标的靶分子进行直接或者间接的检测，也可对适配体与靶分子间的作用方式进行阐述，进一步提高对蛋白质检测的灵敏度，降低了检测限。
3.4 基于多肽的荧光分析法
通过随机的噬菌体而获得的多肽，其性能在很多方面都优于抗体。多肽常常具有某种特性（例如识别结合）是与它的基因序列有着一系列关联的。噬菌体也就是感染细菌的病毒，作为外源的DNA链的表述载体，能将被感染的宿主表达为一种多肽。噬菌体的外源基因，可以进入一个噬菌体外壳的蛋白基因中，所需要的氨基酸序列，将与内源基因相融合，从而产生一个新的杂交融合性蛋白。当细胞将它们释放时，这个杂交的蛋白外壳，就会插入到噬菌体的微粒之中，多肽就被表现在了病毒粒子之上。
基于多肽的荧光分析法，是一种基于多肽作为分子识别的物质的一种荧光分析方法，可以分为荧光分析增强法、荧光分析猝灭法。多肽荧光探针在如今细胞成像的分析当中，已经成功应用。一个理想的多肽探针，对于目标物将具有很高的亲合性以及专一性。现如今，与不同疾病相关的靶向的受体以及特定的多肽已经合成。这些目标多肽将在精准的荧光标记的技术帮助之下，形成多肽的荧光探针，继而通过与受体的蛋白结合，或者被受体的蛋白作用从而发出荧光，达到检测所研究目标蛋白的目的。多肽的荧光探针都是以发生了荧光而作为检测蛋白质的信号，所以可以用于靶向目标蛋白的分子成像，成为现代临床疾病的诊断中不可或缺的技术，提供了疾病信息较为精确以及专一的诊断。
【参考文献】
[1]I.Timtcheva，V.Maximora，T.Deligeorgier，et al.New asymmetricmonom ethine cyanine dyes for nucleic-acid labeling：absorption and fluorescence spectral characteristics[J].J Photochem photobiol A：Chemistry， 2000，130：7-11.
[2]T.Maruyama，T.Takata.Simple detection of point mulations in NDA oligonucleotides using SYBR Green[J].Biotechnol Lett，2003，25（19）：1637-164.