瘢痕疙瘩发病风险与Ｆａｓ基因－６７０位点多态性
[摘要]目的：研究Fas基因-670位点多态性与瘢痕疙瘩发病风险的关系。方法：采用聚合酶链反应-反向点杂交、DNA直接测序方法，检测了75例瘢痕疙瘩患者与120名正常对照的Fas基因-670多态性位点的基因型。结果：瘢痕疙瘩患者的A等位基因频率明显高于正常对照组(χ2=4.408,P=0.036)。瘢痕疙瘩患者的A/G、G/G基因型频率与正常对照组相比差异无统计学意义(χ2值分别为1.051和1.134;P值分别为0.305和0.287)，而瘢痕疙瘩患者的A/A基因型频率明显高于对照组(χ2=5.207,P=0.022)。提示A/A基因型者患瘢痕疙瘩的风险性明显高于A/G、G/G基因型者(OR=2.122,95%CI:1.105～4.077)。结论：Fas基因-670多态性位点的基因型检测可能对判断瘢痕疙瘩高危个体具有指导意义。
[关键词]瘢痕疙瘩；Fas基因；多态性；遗传易感性
[中图分类号]R619+.9[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-03
Fas gene -670 polymorphism and susceptibility to keloid in a Chinese population
ZHUO Yang,ZENG Xing-ye, ZHOU Xue-xue,HUANG Da-dao,CAO Xiao-en,HUANG Zheng-lian
（Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000,Zhejiang, China）
Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between Fas-670 polymorphism and susceptibility to keloid in a southern Chinese population.MethodsThe Fas-670 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 75 patients with keloid and 120 uelated healthy controls.ResultsThe frequency of the Fas-670 A allele among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4. 408,P=0.036). The A/G and G/G genotype distribution among keloid patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=1.051 and 1.134; P=0.305 and 0.287, respectively). However, the A/A genotype frequency among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.207,P=0.022). The Fas-670 A/A genotype significantly increased the risk for developing keloid,compared to the combination of A/G and G/G genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.122, (95%CI: 1.105～4.077).ConclusionDetermination of the Fas-670 genotype may be used as a stratification marker to predicate high-risk individuals for keloid.
Key words: keloid; Fas gene; polymorphism; genetic susceptibility
近几年的研究结果提示，瘢痕疙瘩成纤维细胞的过量增生和凋亡相对减少在瘢痕疙瘩的发生、发展中起着重要作用[1]。而Fas蛋白是细胞表面一种与凋亡相关的抗原，Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的最主要通道。为此,我们从分子遗传学角度，探讨Fas基因-670位点多态性与浙江地区汉族人群瘢痕疙瘩发病风险的关系, 以便深入地、多层次地解析瘢痕疙瘩的分子生物学机制。
1对象和方法
1.1 研究对象：瘢痕疙瘩患者和正常对照人群均为浙江地区汉族居民。瘢痕疙瘩患者均经本院临床及病理诊断证实，共75例，其中男41例、女34例,年龄9～53岁，病变位于前胸、三角肌区及耳垂，病史6个月～15年。正常对照为有外伤史而无瘢痕疙瘩产生，且无瘢痕疙瘩家族史的健康居民，共120例，其中男69例、女51例,年龄13～60岁,平均年龄29.6岁。用于基因分析的DNA全部来源于研究对象的外周静脉血，血样本用枸橼酸钠抗凝，置于-20℃保存备用。
1.2聚合酶链反应-反向点杂交（PCR-RDB）
1.2.1基因组DNA提取：采用北京赛百胜生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
1.2.2 ASO（等位基因特异性寡核苷酸）探针设计：应用Primer Premier5.0设计探针，氨基标记，探针序列分别为：NH2-5′-CATTCCAGGAACGTCTGTGA-3′；NH2-5′- CATTCC AGA AACGTCTGT GA -3′，由上海生工生物公司合成。
1.2.3 PCR反应：用于扩增Fas基因-670位点的引物5′端标记了非同位素检测介质Biotin,引物序列为：Bio-5′- TGTTCACCAGAGCACGAAAG -3′；Bio-5′- GCTGGC ATCTCACTTCAGGT -3′，由上海生工生物公司合成。反应在PE-480型扩增仪(美国PE公司)上进行。在50μl反应总体积中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎国生物公司)。热循环参数：95℃热启动2min后，95℃45sec，55℃1min，72℃/2min；共35个循环 72℃延伸 10min。取3μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察结果。
1.2.4 杂交：固化上寡核苷酸探针的膜条连同40μlPCR产物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的试管中，100℃水浴变性7min，置杂交仪中42℃杂交3～6h；然后放入42℃预热的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；将膜条转入含2.5U辣根过氧化物酶连链酶抗生素蛋白的10ml 2×SSC～0.1%SDS试管中，室温反应15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，将膜条转入20ml显色液[19ml 0.1mol/L柠檬酸钠(pH5.0)中加30%过氧化氢3μl和0.1mg/ml TMB]中避光显色5～15min,期间观察、记录结果。
1.3 为检验反向点杂交结果的正确性，随机抽取18例PCR扩增产物送上海生工生物公司测序。
1.4 统计学处理：应用SPSS10.0统计软件包处理数据，采用χ2检验分析各组等位基因和基因型频率分布的差异，并计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidenceinterval,CI)。
2结果
根据我们设计的方案，杂交结束后膜条上格显示蓝紫色斑点为A/A基因型，中格显示蓝紫色斑点为G/G基因型，而上、中全部显示为A/G基因型，下格为空白对照，无斑点显示（图1）。瘢痕疙瘩组和正常对照组Fas基因多态性比较如表1、2所示。
实验中，在瘢痕疙瘩和正常对照组间的年龄构成比例相似，对照组及瘢痕疙瘩患者组的Fas-670位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡的情况下，结果显示：①瘢痕疙瘩组的A等位基因频率(54.7%)明显高于正常对照组(43.8%)(χ2=4.408,P=0.036,P＜0.05)；而瘢痕疙瘩患者的A/G、 G/G基因型频率分别为40.0%和25.3%， 与正常对照组相比差异无显著性 (χ2值分别为1.051和1.134； P值分别为0.305和0.287)；②瘢痕疙瘩组的A/A 基因型频率为34.7%，明显高于正常对照组(χ2=5.207,P=0.022,P＜0.05)。与A/G、G/G基因型相比，A/A 基因型者患瘢痕疙瘩的相对风险性(OR)明显增高(OR=2.122,95%CI: 1.105～4.077)。我们随机抽取的18例PCR扩增产物测序结果与反向点杂交结果完全吻合（图2），证明了聚合酶链反应-反向点杂交结果的正确性。
3讨论
近年来，遗传因素在许多疾病的发生中所起的重要作用备受重视，且已发现了多种易感基因的存在。Fas基因即是目前较为关注的与瘢痕疙瘩疾病相关的基因之一。人Fas基因组DNA位于染色体10q24上，是全长36Kb的单拷贝基因，由8个内含子及9个外显子组成，编码335个氨基酸，其全称是factor associated suicide，又称CD95/APO-1，属于NGF/TNF受体家族，其相应的配体及单克隆抗体与之结合后可诱导细胞凋亡。Fas蛋白包括膜外区、跨膜区和膜内区，Fas蛋白的重要功能结构“死亡域”编码区位于膜内区[2]。已证实FasR-FasL系统在调控细胞增殖和凋亡中起着重要的作用[3-4],Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的最主要通道。
Fas 基因启动子区域存在两个多态性位点[5],其启动子-670 核苷酸APG多态性位点位于核转录元件GAS 中,能影响干扰素的信号传导。干扰素与其受体结合后,激发了酪氨酸激酶Jak(janus kinases),使转录信号传导和激活因子-1(signal transducers and activitors of transcription1,STAT1) 酪氨酸磷酸化,磷酸化的STAT1 形成同源二聚体与GAS元件结合,诱导含有GAS元件的基因转录[6]。当然其他细胞因子与其受体结合后,也可通过STAT家族成员诱导含有GAS元件的基因转录[7]。若Fas-670 位点碱基为G,则含有GAS元件的一致序列TTCNNNGAA(N3 位点) ,该序列能被STAT家族的多数成员识别[8],细胞因子-受体作用激活STATs,从而诱导Fas基因转录。而碱基A代替G后,则DNA序列变为TTCNNNAAA,可能影响Fas转录，影响Fas蛋白表达。已有报道其他基因GAS元件能够影响转录水平[9]。
国外对Fas-670位点多态性与自身免疫性疾病相关性研究,提示AA 基因型与白种人类风湿性关节炎的临床亚型相关[10]，系统性红斑狼疮、多发性硬化患者A等位基因频率显著增高[9-10]。然而,国内外尚未见Fas 基因多态性与瘢痕疙瘩的相关性研究。本研究初步结果提示，Fas基因-670位点A等位基因及AA基因型是中国浙江地区人群对瘢痕疙瘩的易感因素。我们的初步研究结果对瘢痕疙瘩的预测诊断及筛选具有较大潜在的临床意义，然而更大样本、更多地域、多民族的印证研究尚有待完善。
本实验采用的聚合酶链反应-反向点杂交方法是由Saiki RK[11]于1989年首次提出，虽然在原理上与正向斑点杂交相似，但却巧妙地反其道而用之,即反方向的将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。近年来应用此法进行β-地中海贫血、囊肿性纤维化等疾病的基因诊断，取得较好效果。该方法分辨率高，技术简便、快速、可靠，其检测结果与DNA测序符合率高，值得推广应用。
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[收稿日期]2007-11-26 [修回日期]2008-02-27
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”