白介素-1对培养人表皮黑素细胞增殖及黑素合成的影响研究

时间：2022-11-22 19:55:13 来源：正远范文网 本文已影响人

对照组，各个浓度各设5个复孔。处理后分别培养24h，48h，72h。相应处理时间后，分别弃去培养基上清，加入含MTT终浓度为0.5mg/ml的新鲜MDCB-153培养基继续培养4h，800rpm离心3min，弃去培养基上清，加入150μl的DMSO溶解甲瓒，37℃孵育15min，于波长为495nm处测吸光度值，记录数据，按公式计算其抑制率。抑制率=（对照组-实验组）/对照组x100%。

1.2.4 黑素合成的测定：采用NAOH法。将处理后的黑素细胞弃去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min后，分别计数后调整细胞数目，取等数量的细胞离心后重悬于100μl的0.5mmol/L的NAOH溶液中， 37℃孵育1h后，各管加入400μl的蒸馏水稀释后，分别于405nm处和450nm测量吸光度值，按公式计算其抑制率。黑素合成抑制率 =[1-(药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度)÷(对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度)]×100%。

1.2.5 流式细胞术检测：细胞培养，计数等如前，按2×105/孔接种到6孔板，浓度100ng/ml的IL-1α处理组，IL-1β处理组和PBS组，空白对照组设置如前，细胞处理72h后，分别收集培养基上清到离心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，消化终止如前。分别收集细胞悬液转到相应的已经收集有各自上清的离心管里，1500rpm离心3min，弃去上清，加入无菌的PBS重悬细胞团块，1500rpm离心3min，重复3次PBS清洗过程后，弃去上清，加入PI溶液，室温避光孵育30min，上机检测。

1.3 统计学处理：全部数据采用 SPSS 统计软件10.0版进行分析。

2 结果

2.1 形态学结果：体外培养的正常人黑素细胞为双极、 三极和多极的树突状细胞，细胞增殖良好,细胞树突之间交织成网 (见图 1)。

2.2 黑素细胞鉴定

2.2.1 L-Dopa染色：第3代黑素细胞经0.1 %L-Dopa染色后镜下见黑素细胞胞质及树突均被染成灰黑色 (见图2)。

2.2.2 Fontana银染：第3代黑素细胞经氨银液避光浸染30min，细胞被染成黑色（见图3）。

2.2.3 S-100蛋白染色：黑素细胞胞质及树突呈棕黄色阳性着色,从而可以鉴定为黑素细胞(见图4)。

2.3 不同浓度IL-1α对人正常皮肤黑素细胞增殖率(%)的影响：黑素细胞增殖的测定结果见表1。各浓度IL-1α实验组对黑素细胞的抑制率较PBS对照组相比有统计学意义(P <0.05#或P<0.01*) 。从表1中可以看出随作用时间增加，黑素细胞抑制率逐渐增加，而且随IL-1的浓度增加，黑素细胞的抑制率也逐渐增加，说明其对黑素细胞的作用呈现出时间和剂量的相关性。

2.4 不同浓度IL-1β对人正常皮肤黑素细胞增殖率(%)的影响：黑素细胞增殖的测定结果见表2。各浓度IL-1β实验组对黑素细胞的抑制率较PBS对照组相比有统计学意义(P <0.05#或P<0.01*) 。从表2中可以看出随作用时间增加，黑素细胞抑制率逐渐增加，而且随IL-1β的浓度增加，黑素细胞的抑制率也逐渐增加，说明其对黑素细胞的作用呈现出时间和剂量的相关性。

2.5黑素合成的测定结果：见表3。405nm处和450nm处分别测量吸光度值，按公式计算其黑素合成抑制率，均可见IL-1α及IL-1β作用后黑素合成抑制率增加，而且IL-1α及IL-1β组与PBS组比较统计学上均有显著性差异（P<0.05#），但IL-1α及IL-1β两组之间比较统计学上无显著性差异（P＞0.05）。

2.6流式细胞术检测：浓度为100ng/ml 的IL-1α及IL-1β作用于黑素细胞72h后用流式细胞术检测的结果：空白对照组黑素细胞凋亡率为5.5%，溶剂PBS组黑素细胞凋亡率为6.7%，IL-1α（100ng/ml）组黑素细胞凋亡率为57.3%。IL-1β（100ng/ml）组黑素细胞凋亡率为56.6%。IL-1α（100ng/ml）组黑素细胞凋亡率与空白对照组及溶剂PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。IL-1β（100ng/ml）组黑素细胞凋亡率与空白对照组及溶剂PBS组比较差异也有统计学意义（P <0.01）。但IL-1α及IL-1β两组之间黑素细胞凋亡率的比较统计学上无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

IL-1 家族有3个主要成员, IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)。IL-1具有介导炎症反应、 促进 T细胞和B 细胞的增殖与分化 ,参与免疫调节、 影响代谢、 刺激造血细胞及引起发热等多种生物学作用[6]。人类皮肤内的IL-1主要形式是IL-1α, IL-1β是次要形式[6-7]。Swope[8]等研究发现IL-1、 IL-6及TNF-α三种细胞因子可抑制培养黑素细胞的酪氨酸酶活性,其中IL-1最为明显,此外它们还能抑制黑素细胞的生长，但无细胞毒性作用,故认为它们可能是阻碍黑素细胞黑素生成的重要因素。本研究建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系后 , 用不同浓度的IL-1α和IL-1β作用于黑素细胞后也发现IL-1α、IL-1β对黑素细胞活力有抑制作用 ,能使细胞增殖力降低,两者存在明显的剂量和时间效应。浓度越高，抑制率越强，与 Swope等[8]的研究一致。本研究还发现IL-1α、IL-1β还可导致黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率。顾劲松等[9]采用放射免疫分析法测定白癜风患者血清细胞因子水平，泛发性患者血清IL-1β水平均显著高于对照组。Lu Y等[10]学者用角质形成细胞分泌的IL-1处理黑素细胞发现可以刺激括细胞间黏附分子-1的显著表达。LePoole等[11]观察到, 白癜风患者皮损处黑素细胞周围基质中, 细胞间黏附分子表达明显增高，高表达的细胞间黏附分子可以显著抑制黑素细胞与纤维粘连蛋白的黏附, 导致黑素细胞缺失。IL-1作为多功能的促炎症细胞因子,是否为参与引起炎症后色素脱失的主要因素，在白癜风的发病过程中起着怎样的作用， IL-1α、IL-1β究竟是通过什么通路和机制达到这些作用还有待进一步的深入研究。

[参考文献]

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[3]项蕾红,郑志忠,祝绿川,等.黑素细胞体外纯培养及生物学特性鉴定[J].临床皮肤科杂志, 2001,30（3）:166-167

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[5]陈菊萍,冉玉平,魏大鹏,等.人黑素细胞培养最佳条件的选择和生物学鉴定[J].中国麻风皮肤病杂志,2007,23（3）:214-216.

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[9]顾劲松,涂彩霞,谭雪晶,等.白癜风患者血清白介素、肿瘤坏死因子α及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子检测[J].中华皮肤科杂志,2003,36（2）:73-75.

[10]Lu Y,Zhu WY,Tan C,et al.Melanocytes are potential immunocompetent cells: evidence from recognition of immunological characteristics of cultured human mel anocytes[J].Pigment Cell Res,2002,15（6）:454-460.

[11]LePoole IC,vanden Wijngaard RM, Westerhof W,et al.Tenascin is overexpressed in vitiligo lesional skin and inhibits melanocyte adhesion[J].Br J Dermatol,1997,137（2）: 171-178.

[收稿日期]2012-02-21[修回日期]2012-04-03

编辑/张惠娟

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