RhoA/ROCK途径在高血压发病机制中的研究进展
[摘要] RhoA/Rho激酶（RhoA/ROCK）途径在许多病理状态中起重要作用。RhoA蛋白参与了血管平滑肌张力的调节并激活许多下游激酶。ROCK是RhoA的下游激酶之一，ROCK在局部血流和血压中发挥各种重要功能。ROCK激活可维持肌球蛋白轻链激酶的活性导致肌动蛋白/肌球蛋白的相互作用和平滑肌细胞的收缩，这一作用独立于游离胞质钙的水平。本文对RhoA/ROCK与高血压之间的关系作一综述，更好地理解这一通路在高血压中的作用机制。
[关键词] RhoA/RO激酶；高血压；活性氧；血管紧张素 Ⅱ
[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）05（c）-0028-05
[Abstract] RhoA/ROCK pathway plays an important role in many pathological diseases. RhoA participates in the regulation of smooth muscle tone and activates many downstream kinases. ROCK is one of the downstream kinases of RhoA. ROCK is necessary for diverse functions such as local blood flow， arterial/pulmonary blood pressure. ROCK activation permits actin/myosin interactions and smooth muscle cells contraction by maintaining the activity of myosin light-chain kinase， independently of the free cytosolic calcium level. The focus of this review is on the involvement of RhoA/Rho-kinase in hypertension， before exploring the most recent findings regarding this pathway.
[Key words] RhoA/ROCK； Hypertension； ROS； Ang Ⅱ
高血压是一种多因素疾病，其特征为周围血管阻力增加且伴随着平滑肌细胞肥大和增生。Rho激酶（ROCK）是RhoA/ROCK途径中研究最广泛的小G蛋白RhoA的效应物。已经观察到在各种心血管疾病包括高血压中RhoA/ROCK信号存在异常。RhoA/ROCK途径在平滑肌细胞功能中发挥重要作用，包括细胞收缩、增殖和迁移。RhoA/ROCK信号也与许多因子相互交叉而发挥作用。本文总结了RhoA/ROCK通路在高血压调节中至关重要的作用和此途径的治疗潜力。
1 RhoA/ROCK途径的结构和生物学作用
Rho家族蛋白可以通过脂质化修饰作用锚定于细胞膜，他们可以在GTP-和GDP结合状态之间循环[1]。RhoA可以表现出GDP/GTP结合活性和GTP酶活性双重活性，在GDP-失活状态（GDP-Rho）和GTP-激活状态（GTP-Rho）中作为一个分子开关，使RhoA的活性被循环调节。当细胞被不同的受体激动剂所刺激时，GDP-Rho可通过鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）（功能为刺激GTP转化为GDP）的作用转化为GTP-Rho，之后GTP-Rho通过它的C-末端尾部定向结合至细胞膜并与其特异性靶点相互作用。在休眠细胞，Rho GDP解离抑制剂（Rho GDI）与GDP-Rho结合并从胞膜释放GDP-Rho到胞质。ROCK是含有N-末端催化激酶结构域的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它已被确定为的RhoA的下游效应因子，介导钙敏化。RhoA小GTP酶（GTP酶的RAS超家族单体中的Rho亚家族的一员）是各种胞外信号的分子开关，并且涉及各种生物的细胞功能，包括收缩、迁移、黏附，细胞周期进程和基因表达。这些功能是经RhoA通过ROCK（Rho的最适作用因子）所调节。它存在两个亚型：ROCKⅠ和ROCKⅡ。ROCK不仅可以由RhoA激活，也可以由花生四烯酸激活，而花生四烯酸又可由血管从平滑肌释放并响应于各种激动剂。
目前已经明确许多ROCK的作用靶点，包括肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白结合亚基（MBS），埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白（ERM）家族，内收蛋白，波形蛋白（中间丝），Na+H+交换体，和LIM激酶，磷酸化丝切蛋白。在这其中，ROCK的一个主要的亚基是肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP），它在生理过程中负责球蛋白Ⅱ（MLC20）的轻链磷酸化。因此，MLCP磷酸被认为是ROCK活化的标志，ROCK也可以直接磷酸化MLC。鉴于MLCP的灭活与MLC的磷酸化增加有关，ROCK活化的总的效果与增加的MLC磷酸化一致。当被激活时，ROCK可磷酸化MLCP的肌球蛋白结合亚基（MBS），肌球蛋白的磷酸化或活化使分子与肌动蛋白之间相互作用，导致血管平滑肌收缩。平滑肌细胞（SMC）的收缩是通过两个主要机制：Ca2+信号通路和RhoA/ROCK信号通路。RhoA/ROCK可以改变收缩系统的Ca2+的灵敏度[2]，它的活化抑制内皮一氧化氮合酶，从而改变一氧化氮（NO）的产生。已经在人类和动物研究中证明，这两个过程受损参与了某些病理状态，尤其是高血压等血管性疾病[3]。这些病程表现出一个共同点：ROCK信号传导已成为肌动蛋白细胞骨架的快速和动态重组的一个主要的控制开关。
2 RhoA/ROCK途径抑制剂
RhoA/ROCK途径在过去的十年中被广泛研究，但对于此信号传导级联通路许多方面仍不清楚。RhoA在介导细胞功能中发挥重要作用，并且与血管张力、炎症和氧化应激的调节有关，抑制此途径或许具有显著而深远的临床意义。使用最广泛的抑制剂是吡啶衍生物——Y27632，它可以竞争ROCK的ATP结合位点，从而抑制激酶活性。因此，它可以防止MYPT-1的磷酸化，并抑制平滑肌收缩。Y27632通过载体易化扩散机制转运到细胞内，使得细胞内外化合物浓度相同。Y27632对ROCK亚型没有特异性，可同时抑制ROCKⅠ和ROCKⅡ。Y27632是抑制Rho激酶合适的选择，且对PKC、PKA及MLCK的抑制作用很低，是分析ROCK参与在正常和病理状态下的心血管过程的一个重要的药理工具。另一个抑制剂法舒地尔来源于异喹啉衍生物的化合物，显示出了类似的ROCK抑制作用，其抑制机制也是竞争ATP结合激酶。相比较Y27632，法舒地尔也发挥了PKA及PKC抑制作用，其半抑制率（IC50，分别为5 μmol/L和37 μmol/L）比ROCK（IC50为1 μmol/L）高5～30倍。羟基法舒是法舒地尔的口服给药后的主要活性代谢物，对ROCK有一个更特异性的抑制效果（IC50为0.7 μmol/L）。这两者是最广泛用于实验的是两个非选择性抑制剂，但这些抑制剂不能区分ROCK亚型。由于缺乏特异性的药理学抑制剂，ROCK在血管中的确切作用的研究被极大地限制了。然而，ROCK的抑制剂也已经极大地促使对血管疾病的改变机制了解，并且有助于探讨其治疗意义。许多研究表明ROCK抑制剂Y-27632和法舒地尔，可能是治疗高血压和动脉粥样硬化以及其他的心血管疾病的潜在的药物。最近，一种新的和有效的选择性ROCK抑制剂SAR407899，被证明其效果优于法舒地尔和Y-27632，是一种有前途的抗高血压药物。然而，对高血压的临床治疗仍需要更深入的研究。
3 RhoA/ROCK途径在高血压实验动物模型中的作用
高血压是最常见的心血管疾病之一，其特点是血管张力改变和血管收缩增强最终导致高血压[4]。高血压伴随着增殖，血管平滑肌细胞的迁移，并改变动脉壁的炎症水平，它们共同构成了血管重塑过程。RhoA/ROCK通路参与高血压的发展[5]。研究表明，ROCK通路在自发性高血压大鼠（SHR）和高血压患者中表达增加[6-7]。ROCK途径在动脉血压的调节中起着关键作用。ROCK信号在高血压中的作用于1997年被首次发现。这个发现报道了ROCK抑制剂可以减少三种实验高血压模型的动脉血压水平。此外，ROCK还可以通过对中枢神经系统的直接作用调节血液流动或负性调节内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达和活性间接影响血压。Y27632可通过阻断ROCK的活性降低SHR的去氧乙酸酯（DOCA）/盐性以及肾性高血压大鼠的血压，而ROCK抑制剂处理正常血压的大鼠只会导致一个较小的短暂的血压下降。同样，口服法舒地尔可以显著降低SHR的血压。另外，有些研究分离了高血压动物的血管片段，确定了RhoA在高血压中存在活性改变，这提示在高血压的病理过程中RhoA活性增加会导致ROCK的功能增强。在SHR和血压正常的大鼠肠系膜动脉和脑动脉中，用Y27632处理后，血管舒张情况显著高于SHR的动脉。这种作用也在DOCA盐处理的大鼠中得到证实。在用L-NAME（NO合酶抑制剂）处理的动物中，GTP结合型RhoA的活性在大鼠血管明显增强，而口服Y27632可以显著降低血压。同样，在中风倾向的SHR，DOCA/盐处理性高血压大鼠也发现了RhoA活性升高的证据。RhoA蛋白表达水平的分析显示RhoA在高血压的状态下表达是增加的，尽管在有些研究[8]中并没有显示RhoA/ROCK途径的蛋白表达有显著差异。Y27632应用于SHR和L-NAME高血压大鼠可以降低血压并衰减增强的交感神经活性。另外，在高血压大鼠的脑干膜结合的RhoA和Rho-kinase活性也是增加的。
4 RhoA/ROCK途径在临床高血压中的作用
增强的ROCK活性在临床高血压中也有报道。前臂血流测定显示，在高血压患者中，静息前臂血管阻力比正常血压者较高。法舒地尔可增加前臂血流分级动脉灌注，且这种血管阻力的降低在高血压患者表现更加明显。用硝普钠代替法舒地尔，这种血管扩张反应在两组没有显著差异。这产生一个结论：RhoA/ROCK活性的增加参与了临床高血压的血管阻力增加。此外，心衰患者动脉内灌注法舒地尔可降低血管阻力前臂并增加前臂血流。在吸烟者（心血管疾病高风险因素）中研究发现，其前臂的RhoA和ROCK活性升高。另有研究认为RhoA/ROCK途径在高血压中的作用可能与基因相关[9]。ROCK多态性可能参与控制血压。
5 RhoA/ROCK途径与活性氧
另一个在高血压中与RhoA和ROCK的活化相关联的上游分子事件是活性氧（ROS）的形成。有研究发现ROS可以诱导大鼠主动脉的收缩性，且Y27632可降低其收缩性，说明RhoA/ROCK可以被ROS激活。事实上，活性氧增加了活化型的RhoA的表达。空气污染是已知能导致高血压的环境因素。最近的一项研究提示大鼠暴露于空气污染联合血管紧张素（AngⅡ）输注会导致血压增加，并伴随着ROS介导的ROCK活性增加和MYPT-1的磷酸化[10]。
6 RhoA/ROCK途径与血管功能障碍
全身血管阻力增加是人类和实验性高血压的原因。阻力小动脉收缩力增强和血管重塑可能是由钙通道的敏感性增强（由RhoA/ROCK通路介导）所介导。平滑肌收缩和舒张之间的动态平衡是维持多种生物学功能的关键因素，这个动态过程的中断可以导致各种病症。血管平滑肌张力在调节血压和血流中起了根本性的作用。ROCK途径参与了血管平滑肌收缩的过程。平滑肌钙离子的敏感性反映MLCP的活性与肌球蛋白轻链激酶的比率，最终导致血管平滑肌收缩或舒张。一项体内研究表明，内源性加压系统（RAS和SNS）可增加钙增敏作用[11]，此途径通过RhoA/ROCK通路介导。Rho-GEFs是Rho蛋白的重要调节信号，有研究表明RhoA-GEFs在大鼠动脉的表达水平显著高于在心肌、骨骼肌和脑组织的表达水平[10]。血管平滑肌细胞不同于心肌细胞和骨骼肌细胞，血管平滑肌细胞不产生终末分化。因此，它们保留了从静态细胞切换到增殖细胞，从静止细胞到迁移细胞，从收缩细胞到合成细胞的能力[11]。所有这些过程都受到Rho依赖性机制调节，此机制涉及到众多上游信号和下游不同信号的控制[13]。
NO的生物利用度减少可导致血管内皮功能障碍，这可能是由于eNOS的表达降低，eNOS的激活或氧化应激引起的NO失活引起。越来越多的证据表明的eNOS的表达和活性受到RhoA/ROCK途径的调节[13-15]。例如，激活的RhoA/ROCK途径显著抑制profilin1转基因高血压小鼠的肠系膜动脉内皮NO合酶的表达和磷酸化（Ser1177）。ROCK抑制剂或他汀类药物（抑制RhoA的活性）可以增加伴有血管疾病的动物和人的eNOS的mRNA的半衰期并上调eNOS的表达。RhoA/ROCK信号通路可以直接抑制内皮产生NO[14]。ROS也可通过激活Rho/ROCK途径诱导血管收缩[15]。在病理血管内皮层， 内皮细胞源性血管收缩因子（EDCF）可以竞争EDRF，随后诱导血管平滑肌细胞层RhoA/ROCK途径的活化，导致血管收缩活性增强。在临床研究中发现，ROCK抑制剂法舒地尔可降低动脉灌注血压，且这种降低程度在高血压患者中比在正常血压患者中明显，表明ROCK可能参与了高血压患者中乙酰胆碱诱导的内皮依赖性收缩[16]。在SHR的颈动脉，抑制ROCK可引起乙酰胆碱（Ach）剂量依赖性降低的内皮依赖性收缩。此外，Ach诱导的SHR和Wistar Kyoto大鼠主动脉收缩可以被ROCK抑制剂[无论Y27632或HA1077（法舒地尔）]所拮抗[16]。另外，RhoA-ROCK途径介导了高血压中内源性过氧化物依赖性的增强的血管收缩活性[17]，表明抑制ROCK可以减少EDCF介导的反应，这有助于降低血管疾病的动脉血压。
7 RhoA/ROCK途径与AngⅡ
AngⅡ影响许多类型细胞功能，并在很大程度上通过氧化还原敏感性途径调控许多器官系统。在血管系统中，AngⅡ是有效的血管收缩剂并促进炎症肥大和纤维化，这在心血管疾病如高血压的血管损伤和重塑中非常重要。AngⅡ和其受体ATI受体可能是RhoA/ROCK的上游信号分子。相比正常血压的大鼠，Y27632在AngⅡ诱导的高血压大鼠中其舒张动脉的能力更高。特异性阻断AT1受体可阻止不同类型的实验性高血压大鼠模型RhoA和ROCK活性的上调[18]。AngⅡ通过Noxs家族（包括Nox1、Nox2、Nox4和Nox5）调节血管细胞生成活性氧。Noxs的激活导致ROS的产生，这反过来又影响AngⅡ的下游信号指标，包括RhoA/ROCK[19-20]。这些氧化还原敏感性路的激活调节血管细胞的生长、炎症和收缩，从而导致高血压。RhoA和其下游靶点ROCK的激活日益被视为AngⅡ诱导血管收缩的重要机制，并参与高血压的病理生理机制[21-22]。RhoA/ROCK也影响血管平滑肌细的迁移，这个过程是氧化还原敏感性的，因为夹竹桃麻素，抑制氮氧化物的活性和活性氧的产生，可以阻断AngⅡ刺激的效果。在肾血管，α2肾上腺素受体可能使肾血管响应于AngⅡ，从而影响血管阻力，这涉及到RhoA/ROCK，活性氧和Nox2，因为Ang Ⅱ的作用可被Y27632所衰减[23]。AngⅡ也可通过RhoA/ROCK途径抑制肌球蛋白轻链磷酸酶活性，增加钙离子的敏感性而诱导血管收缩。RhoA也可以调节AngⅡ诱导的血管内皮细胞微粒的释放[24]。在培养的内皮细胞和AngⅡ输注的大鼠中的研究表明，法舒地尔和夹竹桃麻素（分别为ROCK和Nox的抑制剂）可使微粒的形成过程变“迟钝”[25]。这些过程提示AngⅡ参与介导了内皮细胞的氧化损伤。Rho蛋白在血管的多样性和高水平表达可能在血管平滑肌功能调节中起重要作用。例如，Rho蛋白的活性依赖于Rho交换因子（Rho-GEFs），而Arhgef1、Arhgef11是RhoA-GEFs的一部分。在主动脉、肺动脉和肠系膜动脉三种动脉中，Arhgef1参与维持RhoA的活性和AngⅡ诱导的ATR1介导的收缩过程，而Arhgef11参与了AngⅡ诱导的RhoA活化的早期阶段。另外，ROCK抑制剂降低基础血管张力，减轻G蛋白偶联受体激动剂，如AngⅡ诱发的血管平滑肌收缩。虽然有很多证据表明对RhoA/ROCK在AngⅡ中的作用，但是关于AngⅡ如何通过这个途径发挥细胞特异性作用的研究仍然很有限，需要更进一步的研究来阐明。
8 展望
由于越来越多的研究提示，RhoA/ROCK途径在高血压中病理机制中的作用不可否认，ROCK是一个重要的治疗靶点。RhoA/ROCK途径各个靶点的特异性强效药理学调节剂对高血压的干预治疗非常重要。总而言之，高血压和RhoA/ROCK途径上调密切相关。RhoA/ROCK通路上调导致MLCP和eNOS受到抑制，从而使MLCK活性增加。这两起事件促进了血管收缩，并加重高血压发展。然而，对 RhoA/ROCK活化的确切作用过程以及它的失调引起的后果需要更进一步的研究，以便于更好地理解这个途径在高血压中的作用机制。
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（收稿日期：2015-01-15 本文编辑：苏 畅）