阿尔泰瑞香提取物的体外抗炎及抗氧化活性
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〔摘要〕 目的 探讨阿尔泰瑞香二氯甲烷提取物（Da-Dm）的体外抗炎及抗氧化活性。方法 以不同浓度（1、6、30 μg/mL）的Da-Dm作用于脂多糖（LPS，1 μg/mL）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞，采用CCK-8法测定Da-Dm对细胞增殖的影响;Griess法检测细胞上清液中一氧化氮（NO）的释放量;ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的分泌量。以维生素C为对照，采用FRAP法、DPPH法评价Da-Dm总抗氧化能力。结果 Da-Dm在浓度为30 μg/mL及以下时对RAW264.7细胞增殖没有影响。与LPS组比较，1～30 μg/mL的Da-Dm可明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量（P<0.05，P<0.01），并呈现浓度依赖性。Da-Dm对DPPH自由基有较好的清除能力，其清除率的IC50为318.1 μg/mL，在FRAP实验中其对Fe2+离子具有较强的还原能力。结论 Da-Dm可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，它的抗炎作用可能与抑制NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的释放有关。Da-Dm具有较好的抗氧化活性。
〔关键词〕 阿尔泰瑞香;二氯甲烷提取物;RAW264.7细胞;炎症介质;抗氧化作用
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.009
〔Abstract〕 Objective To explore the in vitro anti-inflammatory and antioxidant activities of the dichloromethane extracts from Daphne altaica Pall （Da-Dm）. Methods Mice RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharides （LPS， 1 μg/mL） were treated with different concentrations of Da-Dm （1， 6， 30 μg/mL） respectively. The proliferation of RAW264.7 cells was determined by CCK-8 method; the output of nitric oxide （NO） in the cell supernatant was evaluated by Griess reagent assay; the secretion volumes of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6） were detected by ELISA. The total antioxidant activity of the Da-Dm was evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） assay and ferric reducing-antioxidant power （FRAP） assay， and vitamin C （Vc） was used as a positive control. Results Da-Dm with the concentration of 30 μg/mL and below had no influence on the the proliferation of RAW264.7 cells. Compared with the LPS group， 1-30 μg/mL of Da-Dm in the LPS-induced RAW264.7 cells greatly inhibited their release of inflammatory mediators， such as NO， IL-1β， IL-6 and TNF-α （P<0.05， P<0.01）， in a dose-dependent manner. The Da-Dm exhibited good DPPH radical cleaning power and good Fe2+ reducing power. The median inhibitory concentration （IC50） of scavenging DPPH radical was 318.1 μg/mL. Conclusion Da-Dm can inhibit LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 cells， and its anti-inflammatory effect may be related to the reduction of the release of inflammatory cytokines， like NO， IL-1β， IL-6 and TNF-α. The antioxidant activity of Da-Dm is strong.
〔Keywords〕 Daphne altaica Pall; dichloromethane extracts; RAW264.7 cells; inflammatory cytokines; antioxidant
阿尔泰瑞香（Daphne altaica Pall.）为瑞香科瑞香属植物阿尔泰瑞香的干燥茎皮，其主要分布于阿尔泰山脉[1]。其味辛、温，有毒。具有发汗解表、止咳祛痰、温中止痛的功效[2]，长期以来在哈萨克传统医学中广泛应用于胃癌、气管炎、风湿性关节炎[3-4]等疾病的治疗。有研究表明，阿尔泰瑞香正己烷提取物能够抑制人食管癌 ECA-109细胞的增殖[5]，其二氯甲烷提取物和甲醇提取物均对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60细胞的体外增殖具有明显的抑制活性[6]。但阿尔泰瑞香的体内外抗炎抗氧化作用卻鲜见报道。故本实验选取二氯甲烷提取物为实验对象，利用脂多糖（LPS）诱导的体外炎症模型来初步分析阿尔泰瑞香的抗炎效果，并对其体外抗氧化作用也进行了分析，以期对阿尔泰瑞香的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 药材
阿尔泰瑞香由伊犁州中医医院哈药研究所于2018年1月提供，其原植物经新疆农业大学吾买尔夏提·塔汉教授鉴定为瑞香科属植物阿尔泰瑞香Daphne altaica Pall。
1.2 主要试剂
RAW264.7小鼠巨噬细胞株（北京北纳创联生物技术研究院）;维生素C标准品（中国食品药品检定研究院，批号：100425-201504，含量为100.0%）;DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司，批号：8118174）;胎牛血清（依科赛生物科技有限公司，批号：11G145）;脂多糖（LPS，美国Sigma-Aldrich公司，批号：028M4021V）;CCK8试剂盒（北京全式金生物有限公司，批号：J30608）;地塞米松（上海麦克林生物生化科技有限公司，批号：C10187631）;NO试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20180725）;TNF-α试剂盒（批号：A28280643）、IL-1β试剂盒（批号：A201B80633）、IL-6ELISA试剂盒（批号：A20680724）均购自于杭州联科生物技术有限公司;TPTZ（批号：111758-1701）、DPPH（批号：10257-1708）均购自于北京百灵威科技有限公司;其余试剂均为分析纯。
1.3 主要仪器
CO2细胞培养箱、生物安全柜（上海力康仪器有限公司）;台式低速离心机（上海飞鸽仪器有限公司）;恒温箱、恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;荧光倒置显微镜（日本尼康公司）;酶标仪（Bio-Rad公司）。
1.4 体外抗炎实验
1.4.1 阿尔泰瑞香二氯甲烷提取物（Da-Dm）的制备 取阿尔泰瑞香干燥茎皮150g，以药材与正己烷为1：10的比例回流1 h（提取2次），弃去正己烷提取液，继续将药材与二氯甲烷为1∶10的比例回流1 h（提取2次），将阿尔泰瑞香二氯甲烷提取液过滤，合并提取液，减压浓缩，冷冻干燥得Da-Dm。
1.4.2 细胞培养与传代 用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养液（含100U/mL青霉素和链霉素）于5%CO2、37 ℃恒温培养箱进行培养。取对数生长期的RAW264.7小鼠巨噬细胞进行实验。
1.4.3 分组 取对数生长期的RAW264.7细胞随机分为6组。空白对照组：加入等体积的培养液;炎症模型组：只用1 μg/mL的LPS处理而不加药物干预;LPS+阳性对照组：10 μM的地塞米松（DM）预处理1 h后，再加1 μg/mL LPS干预24 h;LPS+药物组：取不同浓度的Da-Dm（1、6、30 μg/mL），再加1 ug/mL的LPS干预24 h。
1.4.4 Da-Dm对LPS诱导后RAW264.7细胞增殖的影响 取对数生长期RAW264.7的细胞，调整细胞密度为1×105/mL的单细胞悬液，以每孔100 μL接种至96孔板中，24 h后按1.4.3实验分组进行干预，每组5个重复，继续培养24 h，每孔加入培养基总体积10 μL的CCK-8 溶液，继续孵育，1 h后用酶标仪测定OD450 nm处的吸光度A，计算细胞存活率。
细胞存活率=（A样品/A空白）×100%
1.4.5 Da-Dm对LPS诱导后RAW264.7细胞NO含量的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度為1×105/mL的单细胞悬液，以每孔300 μL接种至48孔板中，24 h后按“1.4.3”实验分组进行干预，每组5个重复，继续培养24 h，收集上清，按NO试剂盒说明进行检测。
1.4.6 Da-Dm对LPS诱导后RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1×105/mL的单细胞悬液，以每孔300 μL接种至48孔板中，24 h后按“1.4.3”实验分组进行干预，每组5个重复，继续培养24 h，收集上清，按ELISA试剂盒说明进行检测。
1.5 体外抗氧化实验
1.5.1 FRAP法测定Da-Dm的抗氧化活性 按照 Benzie等[7]的方法进行进一步修改，精确量取醋酸钠缓冲液（0.3 mmol/L， pH 3.6） 、TPTZ 溶液（10 mmol/L）及FeCl3 （20 mmol/L）溶液，体积比为10∶1∶1的比例混匀，得FRAP工作液，配置FeSO4标准系列溶液，分别取0.1 mL FeSO4标准溶液加入3 mL FRAP工作液，在 37 ℃反应30 min，以蒸馏水为空白，测定溶液在593 nm 处吸光度，建立浓度与吸光度的线性回归方程（y=0.000 7x+0.062 9，r=0.999 6）;用乙醇为溶剂，将VC和Da-Dm配制成一系列待测溶液，将样品代替FeSO4其余操作方法同上，上述实验进行3次，根据标准曲线计算FRAP值。
1.5.2 DDPH法测定Da-Dm的抗氧化活性 将DPPH配制成25 μg/mL的标准储备液，稀释成不同浓度，以95%乙醇为空白，测定上述标准溶液在517 nm处的吸光度，建立浓度与吸光度的线性回归方程（y=0.031 6x+0.007 2， r=0.9996）。用乙醇为溶剂，将VC和Da-Dm配制成一系列待测溶液，取各浓度溶液0.2 mL加入3 mL 25 μg/mL的DPPH溶液，混匀，在37 ℃的水浴中避光反应30 min，测定样品吸光度为Ai，空白组为等体积的乙醇溶液代替DPPH溶液，测得吸光度为Aj，以乙醇代替样品加入DPPH溶液测得吸光度为As，测定波长为517 nm，平行测定3次，根据公式计算清除率I。
I=[1-（Ai-Aj）/As]×100%
1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行分析，多组间比较应用单因素方差分析，实验数据以“x±s”表示，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 Da-Dm对LPS诱导后RAW264.7细胞增殖的影响
CCK-8实验结果显示：当Da-Dm实验浓度为1、6、30 μg/mL时，RAW264.7细胞存活率为101.0%～114.9%，说明各浓度下的药物对细胞无毒性。另外，与空白组比较，LPS作用后RAW264.7细胞活力下降，细胞增殖受到抑制（P<0.01）。与LPS组相比较，加入DM及Da-Dm 24 h后各实验组能均能使细胞增殖抑制状态有所恢复，差异具有统计学意义（P<0.01），说明实验浓度下的药物对RAW264.7细胞有显著的保护作用。见图1。
2.2 Da-Dm对NO释放量的影响
Griess法结果显示，正常RAW264.7细胞上清液中只含有少量的NO，当给与LPS刺激后，LPS组细胞培养液中的NO含量较空白组显著提高（P<0.01），体外炎症模型建立成功。与LPS组相比，加入DM及1、6、30 μg/mL的Da-Dm 24 h后各实验组均能显著抑制NO产生（P<0.05），并呈量效关系。见图2。
2.3 Da-Dm对炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影响
LPS可激活巨噬细胞，诱导其分泌一系列炎症因子，炎症因子的分泌是评价炎症严重程度的一个量化指标，如图3所示，空白组IL-1β、IL-6及TNF-α质量浓度均较低，经LPS刺激后三者释放均显著增加（P<0.01）。用10 μM的DM及1、6、30 μg/mL的Da-Dm处理RAW264.7细胞后，与LPS组相比，加入DM及Da-Dm 24 h后各实验组释放的炎症因子含量均显著降低（P<0.05，P<0.01）（除TNF-α实验中1 μg/mLDa-Dm组），并呈量效关系。见图3。
2.4 FRAP法测定Da-Dm的抗氧化活性
由于FRAP法不是针对某一种自由基清除能力，而是样品总的还原能力，因此可用来反映样品总的抗氧化活性[8]，实验结果表明对铁还原能力强弱顺序为VC>Da-Dm，二者的总抗氧化值与浓度呈正比，虽然Da-Dm对铁的还原能力不及VC，但其也表现出较好的还原能力，见图4。
2.5 Da-Dm清除DPPH自由基的活性
为了更准确地评价样品间的抗氧化活性，常用清除50%自由基时的溶液质量浓度IC50来比较，较低的IC50值说明具有较高的自由基清除能力[9]。在实验浓度范围内，对DPPH自由基清除能力的强弱顺序为Vc>Da-Dm，且其浓度与清除率呈现良好的剂量依赖关系，Vc及Da-Dm的IC50分别为57.8 μg/mL和318.1 μg/mL。说明Da-Dm对自由基有较好的清除能力，能起到较好的抗氧化作用。见表1。
3 讨论
炎症反应是由多种化学因子共同参与调节的，与其具有最密切联系的炎症介质与炎症因子是NO、TNF-α、IL-1β和IL-6[10]。NO在缺氧、炎症和肿瘤等情况下被大量表达，过量表达的NO会与超氧阴离子O2-反应，然后生成过氧化亚硝酸盐，从而导致局部组织产生损伤，其进一步介导了炎症的發生发展，细胞内NO的含量可作为反映炎症损伤程度的一种指标[11]。TNF-α是一种促炎因子，当体内的TNF-α处于低浓度时，可通过自分泌的方式调节白细胞功能，介导炎症反应的发生;而当TNF-α处于高浓度时，可进入血液循环中促进机体的体温升高，TNF-α也可促进中性粒细胞的粘附及吞噬功能，促进细胞的呼吸爆发，并协助其它细胞因子（IL-6、IL-1等）的表达[12]。IL-1β可以促进组织的损伤，介导炎性细胞进入病变组织部位，促进细胞产生前列腺素等因子而引发全身反应，IL-1β还可促进巨噬细胞对抗原的识别，吸引中性粒细胞，并且促进炎性介质的释放[13]。IL-6在炎症反应初期被大量的表达，它能使中性粒细胞活性降低，促进炎症介质的产生，导致炎症反应的进程被加速[14]。本实验以炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β及炎性介质NO作为检测指标，来评价Da-Dm的抗炎效果，结果表明，Da-Dm能显著抑制NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，并且呈剂量依懒性，说明Da-Dm抗炎作用的产生可能与抑制NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的释放有关。
自由基是一群具有一个或多个不成对电子且单独存在极短暂的原子、分子、离子或者原子团，正常情况下，体内自由基的产生和消除处于动态平衡中，但是当自由基产生过多或消除过慢时，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织水平的损伤而诱发疾病。在抗氧化实验中Da-Dm表现出了较好的清除DPPH自由基能力及FRAP抗氧化能力。
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