无菌性脑膜炎主要病原Echovirus,30快速检测系统的建立
【摘要】目的：建立一套造成无菌性脑膜炎的主要病原Echovirus 30的快速检测系统，增加I临床病例的快速筛查和检测。方法：通过对Echovirus 30病毒基因组的核酸序列比对，设计出针对Echovirus 30的特异性检测引物，并对2011年5月-8月间在中国南方地区的一次无菌性脑膜炎爆发流行进行报道和病原检测。结果：在188例无菌性脑膜炎临床病例中，98.9%为<1 5岁的儿童。所有标本使用肠道病毒通用引物检测阳性的为109例，其中使用E30特异性VP1段引物检测阳性的7 9例，对79株E30的VP1段测序分型显示，引起本次爆发流行的E 30由Ⅶ型造成，而与Ⅰ-Ⅵ型的同源性为69.8%-87%。结论：本研究成功建立了一套快速、简便、特异的Echovirus 30检测系统，并依据该系统第一次报道了在中国南方地区引起无菌性脑膜炎爆发的肠道病毒病原。
【关键词】无菌性脑膜炎；主要病原；临床
无菌性脑膜炎中有35-83%由肠道病毒引起，其中Echovinm占到80-90%，Echovirus 30（E30）是其最主要的病原体，E30可通过粪-口途径传播，感染后通常临床症状不明显，但也有部分病例可引起急性发热或神经系统并发症如脑炎、脑膜炎、胸膜炎、心肌炎、结膜炎等。由E30造成的无菌性脑膜炎在世界范围内广泛流行，尤其是最近10年来其爆发流行有逐渐增多的趋势。
1材料和方法
1.1标本的收集
214份临床咽拭子标本采自2011年5月22日至8月6日间有无菌性脑膜炎临床症状的病例，咽拭子在标本保存液中充分搅动以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞后立即提取病毒RNA或放入-20℃保存。
1.2RNA的提取
从200～1咽拭子中进行病毒RNA的提取，使用磁珠法进行（GenMag Biotechnology，beijing，China），严格按照说明书操作，最终使用50μl的DEPC处理的水进行洗脱。提取的病毒RNA直接进行RT-PCR检测或存放于-80℃备用。
1.3序列分析
测得的序列使用SeqMan软件（Lasergene package，DNASTAR Inc，Madison，WI，USA）进行拼接。序列比对采用ClustalW方法（MEGA4.0，），基因进化树构建采用neighbor-joining方法（MEGA4.0，）。
2结果
所有188例临床病例中有98.9%的病例年龄小于15岁，男女比为23：1（131：57），在年龄分布上本次无菌性脑膜炎爆发中的病例主要集中于3-7岁（88例，46.8%）及10-15岁（48例，25.5%），该年龄分布特点与已报道的手足口病的年龄分布有所不同，手足口病病例主要集中于1-5岁的儿童。在无菌性脑膜炎爆发期间6、7月是其主要流行期，占到所有病例数的85.1%。对本次无菌性脑膜炎暴发流行中的188例临床病例标本进行5’UTR区的肠道病毒通用诊断引物的检测，共有109例诊断为肠道病毒感染（60%）。其中79例经过E30 VP1特异性检测引物诊断为阳性。
在GenBank上下载76株之前报道的E30各型及亚型的分离株VP1序列作为参考株与本次无菌性脑膜炎爆发收集的79株E30-VP1序列进行同源性比对，构建进化树，以核苷酸序列存在12%差异作为基因型的分型标准，所有序列可分为7个基因型（Ⅰ-Ⅶ），各基因型型间核苷酸同源性在63.9%-87.2%之间，型间氨基酸同源性在91.8%-98.6%之间，型内核苷酸同源性在93.7%-97.9%，型内氨基酸同源性在98.4%-99.7%之间，在本研究中分离到的79株E30均为Ⅶ型。
3讨论
E30是造成无菌性脑膜炎爆发流行的主要肠道病毒，其流行特点、基因多样性在欧美和亚太地区有一定报道，但在中国大陆地区对其流行情况的报道则相对较少，其原因主要是还缺乏快速、特异的诊断方法，同时对中国南方地区造成无菌性脑膜炎的E30流行情况也从未进行过相关研究。在2011年春夏季节，在中国南方的厦门市及周边地区出现了一次无菌性脑膜炎的爆发流行，我们通过建立一套针对性较强的快速诊断系统，并对临床标本直接进行PCR扩增从而证明该系统具有较好的检测灵敏度和准确性，从而确定此次爆发中E30均为同一基因型，提示较好的监控手段将有利于新的暴发流行的控制和预防。