体外缺血后处理对缺血再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞间质转变的影响
[摘要] 目的 探讨缺血后处理对肾小管上皮间质转变的影响。 方法 应用NRK-52E建立有效的体外模型，实验分为对照组（COS）：应用对照缓冲液培养，3 h后换完全培养基培养；缺血再灌注损伤组（IRI）：应用缺血缓冲液，3 h后同样更换完全培养基培养；缺血后处理组（IPO）：应用缺血缓冲液培养3 h，立即行体外缺血后处理，然后更换完全培养基。以上各组于处理3、6、12、24 h后收集细胞，Hoechst用于检测细胞凋亡，蛋白印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）的蛋白表达水平。 结果 在经历缺血3 h后再灌注24 h，IRI组和IPO组有明显细胞凋亡，但IPO组凋亡明显较IRI组减轻（P < 0.05）。IRI组α-SMA随时间延长表达逐渐增强，在24 h时表达最强（P < 0.05）；而IPO组随时间延长表达逐渐减弱，在24 h时达到最低值（P < 0.05）。IRI组TGF-β1在缺血再灌注3、6 h时表达较强，之后减弱；且IPO组表达与IRI组相似，但3、6 h时表达水平明显受到抑制。IRI组CTGF在缺血再灌注3、6 h时表达较强，之后减弱；而IPO组表达各时间点较COS组没有明显变化。 结论 体外缺血再灌注损伤可以诱导肾小管上皮细胞α-SMA的表达，诱导上皮细胞间质转化；而原因可能与激活TGF-β1，进而也抑制基质蛋白的降解，促进基质蛋白CTGF的表达等有关；同时IPO能有效抑制α-SMA、TGF-β1、CTGF的表达，说明其能抑制间质转化的发生。
[关键词] 缺血后处理；上皮细胞间质转变；肾纤维化
[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0009-04
肾缺血再灌注损伤不仅可以在短期内引起肾功能不全、衰竭，而且还可以导致慢性肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化是各种病因的肾脏疾病进展到终末期肾病的必要环节，而肾小管上皮细胞间质转变（EMT）在肾纤维化过程中扮演重要角色。因此，本研究利用笔者已经建立的成熟的体外模型，研究体外缺血后处理是否对缺血再灌注损伤导致肾小管EMT产生影响，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 实验细胞
肾小管上皮细胞系NRK-52E购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养于培养皿中，95%空气/5% CO2、pH 7.4、37°C条件下，每2天更换培养液。所有细胞均在实验前用无血清的培养基培养24 h。
1.2 主要药物、试剂
DMEM培养基，胎牛血清（美国，Hyclone）；Annexin V-FICT/PI双染试剂盒（美国，Bender，B MS1031） ；三气细胞培养箱（美国，REVCO公司）；α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体，转化生长因子-β1（TGF-β1）单克隆抗体，结缔组织生长因子（CTGF）单克隆抗体（cell signaling），β-actin单克隆抗体（Santa cruz）
1.3 实验方法
1.3.1 细胞模型的建立
1.3.1.1 对照（COS）组 同步化24 h后，用对照缓冲液1 mL，培养3 h，然后更换DMEM 培养基2 mL，在正常条件下（5%CO2+95%空气、37℃）培养至指定的时间点。
1.3.1.2 缺血再灌注损伤（IRI）组 同步化24 h后，用pH 7.4的无血清DMEM培养液1 mL冲洗已汇合成片的大鼠肾小管上皮细胞，接着用pH 7.4的无糖DMEM培养液1 mL冲洗细胞，再用无血清、无糖的缺血培养液1 mL在缺氧条件下（0.5%O2+5%CO2+94.5%N2、37℃）培养3 h，再灌注时换用完全DMEM培养基2 mL，在正常条件下（5%CO2+95%空气、37℃）培养至指定的时间点。
1.3.1.3 缺血后处理（IPO）组 同步化24 h后，更换缺血缓冲液1 mL，并在缺氧条件下（0.5%O2、5%CO2、饱和湿度）条件下培养3 h，然后添加0.5 mL新鲜的完全培养基，在正常条件下（空气氧浓度、5%CO2、饱和湿度、37℃）培养10 min，模拟再灌注环境，再在缺血条件下（0.5%O2、5%CO2、饱和湿度）培养10 min，模拟缺氧环境，此20 min为1个循环，共计3个循环。最后添加完全培养基2 mL在正常条件下（空气氧浓度、5%CO2、饱和湿度、37℃）培养至指定的时间点。
1.3.2 观察指标与测定方法
肾小管上皮细胞NRK-52E在缺血再灌注损伤和缺血后处理后3、6、12、24 h各时间点，收集细胞提取总蛋白，行Western blot检测肾小管上皮间质变相关指标，如α-SMA、TGF-β1、CTGF蛋白表达。
1.3.3 HOECHST检测细胞凋亡
用预温1×PBS缓冲液，洗涤细胞2次。加入5 μL Hoe chst 33342染色液于各组细胞，轻轻晃动混匀，然后孵育箱避光孵育10 min。 加入5 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，用荧光显微镜检测各组细胞。Hoechst33342的最大激发波长350 nm，最大发射波长为460 nm，PI的最大激发和最大发射波长分别为488 nm和615 nm。
1.3.4 Western blot测定方法
提取细胞总蛋白。SDS-PAGE进行蛋白质分离，电转至NC膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，TBS洗膜。封闭液中按1∶1000加一抗，即相应单克隆抗体（β-actin作参照），缓慢摇动4℃过夜，弃去一抗，TBST洗膜，加羊抗兔IgG二抗，缓慢摇动1 h，TBST洗膜。化学发光法曝光，显影定影，拍照观察胶片上的条带，Quantity One软件分析灰度。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Hochest检测各组细胞凋亡
Hochest检测显示，COS组肾小管上皮细胞没有明显凋亡，IRI组肾小管上皮细胞凋亡明显，而IPO组凋亡明显减少（图1）。
A：COS组；B：IRI组；C：IPO组；与COS组相比，IRI组与IPO组的凋亡细胞数量增多；同时，与IRI组相比，IPO组凋亡细胞数量明显降低；箭头表示凋亡细胞
2.2 Western blot检测结果
肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达结果如图2所示：IRI组α-SMA随时间延长表达逐渐增强，且24 h时表达最强；而IPO组α-SMA随时间延长表达逐渐减弱，24 h表达最弱。在12 h和24 h时间点，IRI组α-SMA表达明显较COS组高，IPO组表达明显较IRI组低（P < 0.05）。
肾小管上皮细胞TGF-β1蛋白表达结果如图3所示：IRI组TGF-β1在缺血再灌注3、6 h时表达最强，之后减弱；而IPO组表达方式与IRI组相似，但表达量明显弱于IRI组（P < 0.05）。在3 h和6 h时间点，IRI组和IPO组TGF-β1蛋白表达较COS组高，IPO组表达较IRI组低（P < 0.05）。
肾小管上皮细胞CTGF蛋白表达结果如图4所示： IRI组CTGF在缺血再灌注3、6 h表达最强，之后减弱；而IPO组表达方式与IRI组相似，但表达量明显弱于IRI组（P < 0.05）。在3 h时间点，IRI组和IPO组CTGF蛋白表达明显较COS组高，IPO组较IRI组低（P < 0.05）。
与IRI组比较，*P < 0.05；与COS组比较，#P < 0.05；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白
与IRI组比较，*P < 0.05 ；与COS组比较，#P < 0.05；TGF-β1：转化生长因子-β1
与IRI组比较，*P < 0.05 ；与COS组比较，#P < 0.05；CTGF：结缔组织生长因子
3 讨论
肾缺血再灌注损伤随着时间的推移，肾功能以及肾脏的病理改变会逐步恢复，但是由损伤导致的肾小管会发生不可逆性改变，表现为肾小管纤维化，从而导致肾小管浓缩功能下降，肾功能不全[1-3]。既往的观点认为再灌注期间，肾小管有很强的增殖修复能力，缺血再灌注可以完全逆转[4]。但近年来有研究发现，肾小管上皮细胞的增殖修复能力是有限的，它依赖于小管细胞存活的数量和基底膜是否完好。一旦损伤程度超过某一临界值，肾小管的损伤就是不可逆的，肾小管的结构和功能就不能完全恢复[5]。有研究发现，中度的肾小管间质纤维化病变虽然没有引起血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）等指标异常升高，但是可以破坏肾小管的尿液重吸收功能，使夜尿增多，出现蛋白尿[5]。EMT的过程最初被描述是作为在胚胎发育授予原始上皮细胞形成中胚层和原始神经上皮转变为神经脊细胞的能力中的早期事件[6-7]。过去10年，越来越多的研究表明，EMT是肌成纤维母细胞在纤维化过程中招募的一个重要直接路径：在导致局部因子成分改变的损伤条件下，成熟的上皮细胞特殊形态消失，穿过肾小管基底膜到间质，最终“分化”为肌成纤维细胞表型，具备合成和沉积细胞外基质能力[8-9]。此外，Iwano等[10]的研究发现，在肾损伤引起的肾纤维化过程中肾小管上皮EMT起了主导作用。IPO的定义是一系列间断、快速、反复的缺血应用在缺血的器官或组织长期缺血之后，长时间再灌注之前。IPO有更多的临床应用价值，许多研究报道证实，IPO可以减轻系统炎症反应，抑制凋亡分子的表达，激活内源性保护分子。因此，本研究利用笔者前期已经建立的体外模型，研究模拟的缺血后处理对肾小管EMT的影响，明确在体外IPO是否能减轻EMT。
α-SMA是肌成纤维细胞的标志，而肌成纤维细胞是成纤维细胞的活化形式，同时也是细胞外基质胶原成分的主要来源[11-12]。在正常肾组织中α-SMA仅在动脉平滑肌细胞中表达，而在本研究中可以看到其表达在IRI组随再灌注时间的延长逐渐增加，且在24 h时最强；而在IPO组表达却随时间延长，逐渐减弱，在24 h时表达最弱；说明在体外缺血再灌注损伤也能够诱导α-SMA表达，诱导肾小管上皮细胞获得间质极性，以及EMT的发生。缺血后处理可以减轻α-SMA表达。
肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏进行性损害导致肾功能不全的共同通路。TGF-β1被认为是众多的致纤维因子中的重要一个，它的主要功能为增加细胞外基质的合成，抑制其降解，整合素基质黏附分子的上调[13-14]。有许多对TGF-β1/Smad通路的研究发现，拮抗TGF-β1活化可以减轻肾间质纤维化[14]。Azuma等[15]研究发现，通过上调TGF-β1可以使肾小管细胞外的基质增加，说明TGF-β1的持续增高有促进纤维化的可能。本研究中肾小管上皮细胞缺血再灌注后3、6 h TGF-β1表达明显增强，而缺血后处理显著减弱其激活表达，表明IPO能够抑制缺血再灌注肾小管上皮细胞内TGF-β1的蛋白表达。
CTGF是一种基质蛋白，在病理性纤维化中扮演重要角色。体内和体外实验研究证实，CTGF表达于肾小管上皮细胞，暗示其参与肾脏纤维化和肾小管上皮EMT。CTGF是慢性移植肾病中EMT的潜在生物标志[16-17]。本研究发现，肾小管上皮细胞缺血再灌注3 h后 CTGF表达明显增强，而缺血后处理能减弱其激活表达，表明IPO能够抑制缺血再灌注肾小管上皮细胞内CTGF的蛋白表达。
缺血再灌注损伤可以诱导肾小管上皮细胞α-SMA的表达，诱导上皮细胞EMT；而原因可能与激活TGF-β1，进而也抑制基质蛋白的降解，促进基质蛋白CTGF的表达等有关；同时IPO能有效抑制α-SMA、TGF-β1、CTGF的表达，说明其能抑制EMT的发生。对缺血后处理减轻肾小管上皮细胞再灌注后EMT的研究，有益于防治肾缺血后纤维化。
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（收稿日期：2013-06-09 本文编辑：程 铭）