甜瓜属植物种间杂交及其杂交后代SRAP分子标记鉴定
摘要：以150个薄皮甜瓜品种为母本，分别与甜瓜野生近缘种角瓜和西印度瓜进行种间杂交，结果仅以编号V2和V129的薄皮甜瓜与角瓜和西印度瓜杂交后能够坐果，但与角瓜杂交后种子败育，而与西印度瓜杂交后仅果实底部有少量可育种子。采用SRAP分子标记技术对V129x西印度瓜杂交后代进行分析表明，1对引物(E14／m2)扩增出少量父本(西印度瓜)特征带，表明西印度瓜与V129甜瓜已经在DNA分子水平上发生了交换。
关键词：甜瓜；种间杂交；SRAP分子标记
甜瓜属可分为甜瓜亚属和黄瓜亚属其中甜瓜亚属植物染色体基数为12，被认为是非洲组，而黄瓜亚属植物染色体基数为7，被认为是亚洲组。除了栽培的甜瓜和黄瓜作物外，甜瓜属还有30种左右野生近缘植物，这些近缘植物食用价值较为低劣，难以直接作为水果、蔬菜加以利用，但某些野生近缘植物具有突出的抗性，如角瓜、酸黄瓜、无花果叶瓜、西印度瓜具有较强的抗根结线虫能力，而生产中的甜瓜和黄瓜品种均缺乏抗根结线虫能力，因此开展甜瓜属植物种间杂交研究对于引入新抗性基因，丰富甜瓜、黄瓜品种类型，拓宽遗传基础具有重要意义。笔者以甜瓜近缘种西印度瓜和角瓜为材料，与150个薄皮甜瓜品种进行种间杂交，旨在筛选与野生近缘种杂交亲和性好的甜瓜品种，为进一步开展甜瓜种间杂交研究寻找合适材料。
1 材料与方法
1，1试验材料
150个甜瓜品种均来自本所国家西瓜甜瓜中期库(表1)，主要为地方品种；野生近缘种为角瓜和西印度瓜，引自美国NC7引种站，编号分别为PI 202681和PI 233646。
1，2试验方法
1，2，1材料的栽培管理试验材料种植于本所联栋温室内。2009年2月15日开始育苗，3月20日定植。甜瓜每个品种定植4株，主蔓4～5片真叶时摘心，子蔓坐瓜；西印度瓜定植30株，不整蔓，子蔓坐瓜；角瓜定植30株，自定植之日起，采用银灰色遮光布进行遮光处理，每天光照时间控制在9：00－17：00，除及时剪掉过密侧蔓外，不作过多整蔓处理。甜瓜采用爬地栽培，角瓜和西印度瓜则采用吊蔓栽培。
1，2，2种间杂交试验中的角瓜材料具有短日照特性，在郑州春夏季光照条件下很难开花，经过1个月的连续遮光处理，4月23日角瓜陆续开花，与甜瓜花期基本一致，为后续的杂交试验创造了条件。4月28日开始种间杂交。以甜瓜为母本、野生近缘种(角瓜和西印度瓜)为父本进行杂交授粉：另以野生近缘种(角瓜和西印度瓜)为母本，随机选择甜瓜为父本进行种间杂交。10d后分别统计坐果率。
1，2，3杂交后代的SRAP标记将杂交后代及其父母本的种子浸种12h后于32℃条件下催芽，播种于营养钵中，幼苗3片真叶时采用CTAB法提取新鲜嫩叶的基因组DNA。
1，2，3，1 SRAP引物
采用Li等发表的引物，包括20条上游引物，20条下游引物(引物序列表略)，共400对引物组合，由包文风在西瓜白化致死近等基因系和F2代群体中筛选出9对SRAP引物组合，分别为E4／M10、E6／m2、E12／M10、E12／M15、E14／m2、E14／M6、E15／M10、E15／M17和GA18／m2(表2)，用于杂交后代及其父母本DNA扩增。
1，2，3，2 PCR反应
扩增程序为：94℃预变性5min：94℃1 min，35℃1 min，72℃2 min进行5个循环；94℃50 s，51℃ 50 s，72℃ 1 min进行35个循环；最后72℃5 min延伸扩增。反应体系总体积10μL包含1μLbuffer(10×PCR)、50ngDNA、0.75 U Taq酶，dNTP、Primer、Mg2+浓度分别为0.05、0.75、2.5mmol·L-1。
1，2，3，3 显色PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，在300W恒定功率下电泳1～2h。银染参照Sanguinetti等㈣的方法，照相拍照存版。SRAP-PCR反应所用的Taq酶、dNTPs均购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由英俊生物技术有限公司合成，其他试剂为国产分析纯。
2 结果与分析
2，1以野生近缘种为母本、甜瓜为父本的种间杂交
以角瓜为母本、甜瓜为父本，共授粉154朵花，均未发现有坐果现象，坐果率为0。以西印度瓜为母本、甜瓜为父本，共授粉167朵花，坐果6个，坐果率为3.6％；果实生长缓慢，且果实畸形，果皮收缩，呈葫芦状畸形，未成熟果皮就开始转变为黄色，剖开果实后发现种子败育，仅残留硬种壳。
2，2以甜瓜为母本、野生近缘种为父本的种间杂交
以角瓜、西印度瓜为父本，分别给150个甜瓜品种授粉，坐果状况调查结果，仅编号V2和V129的甜瓜品种具有良好坐果能力，坐果率在81.2％以上(表3)。但果实早期发育缓慢，授粉后3-4d果实几乎没有明显变化，1周后才开始迅速膨大。为验证种间杂交过程是否遭受花粉污染，在瓜蔓较高节位处重新进行严格去雄和隔离授粉，另以去雄后套袋隔离(不授粉)进行对照，结果杂交授粉雌花均顺利坐果，而对照无一坐果。果实成熟后剖开，发现角瓜为父本的杂交果实种子全部败育，但以西印度瓜为父本的杂交果实顶部(花痕处)有少量饱满种子，去除病害和为观察种子发育取样而损失的果实，V2x西印度瓜收获果实7个，收获成熟种子84粒，V129x西印度瓜收获果实5个，收获成熟种子67粒。
2，3种间杂交后代的SRAP分子标记
为了验证杂交后代是否在DNA水平上产生交换，用筛选的9对引物对甜瓜V2、V129，西印度瓜及其杂交后代DNA进行SRAP扩增，结果都能扩增出清晰条带，并且都能揭示出父母本多态性差异，但只有引物E14／m2在V129x西印度瓜后代中扩增出部分父本特征带(图1，箭头①②所示)和变异带(箭头③所示)。
2，4种间杂交后代植物学性状观察
为了进一步验证种间杂交后代是否产生了植物学形态上的变异，2009年秋季将西印度瓜与V2和V129杂交后代种植观察，其中V2x西印度瓜种植53株，V129x西印度瓜种植41株。结果表明，杂交后代植株的叶、花等植物学形态以及果实性状表现与母本一致(表4)，未产生父本特征形态可见变异。
3 讨论与结论
甜瓜属植物分化类型极端多样化，在长期的演化过程中，不同种间植物形成了较大的生殖隔离。自上世纪中期，国外就开始进行甜瓜种间杂交研究，曾经有过角瓜和甜瓜杂交成功的报道，杂交后代(F1)在植物学性状和同工酶标记上出现了父本角瓜的特征变异，但由于无法重复该试验(包括作者本人)而未被广泛认可。根据现有报道，在甜瓜属植物中目前仅我国陈劲枫教授采用胚挽救和染色体加倍恢复育性技术成功地进行了黄瓜和酸黄瓜种间杂交㈦，因此甜瓜属植物的种间杂交困难较大，难以获得种间杂交后代。本研究利用150个薄皮甜瓜品种与角瓜和西印度瓜进行种间杂交，筛选出2个种间杂交授粉亲和性较好的甜瓜品种，对其进行农艺性状观察表明，二者几乎完全相同，可能为1个品种(即甜瓜品种黄皮糙)，此结果表明在栽培甜瓜中可能存在与野生近缘种杂交亲和性强的材料。而通过秋季重复该种间杂交试验表明，在秋季高温条件下，以V2、V129为母本与角瓜和西印度瓜杂交后坐果率非常低，说明栽培气候条件对种间杂交影响也很大。
本试验严格进行去雄和隔离授粉，坐果后及时重复授粉并设对照验证，应该能排除杂交授粉过程中花粉污染问题，通过对V129×西印度瓜后代SRAP标记表明已经有部分父本DNA片段渗入，在后代扩增出了父本特征带和变异带，但未产生植物学形态上可见变异，出现这种异常现象说明作为远缘杂交的种间杂交存在一些不同于常规杂交的复杂性。在植物远缘杂交过程中，存在染色体消除现象，即亲本一方的染色体在杂种合子或幼胚发育初期被有选择地消除，这是种间生殖隔离的表现方式之一，染色体消除的结果是产生单倍体或二倍体(可能为单倍体自发加倍)后代㈣，并且在后代中可能渗入父本部分DNA片段。至于本试验研究为何出现杂交后代植物学性状观察与分子标记结果不一致，是否存在染色体消除现象有待进一步研究，这对于深入分析甜瓜属植物种间杂交机理将具有重要意义。