地下芽孢杆菌ZDC—01抑菌效果及其防效研究
摘要 对从东海海底土壤沉积物中分离获得的菌株ZDC-01的抑菌活性、抑菌机理、室内防治效果进行了研究。结果表明，该菌株对8种病原菌具有显著的抑菌作用，菌悬液较无菌滤液的抑制率更高，抑制率高达96.87%。通过喷雾处理刺伤接种发现，喷施ZDC-01发酵液、菌悬液的防治效果随时间的延长稍有降低，但仍与腐霉利处理相当，而无菌滤液的防治效果较差，7 d后仅为9.53%。
关键词 菌株ZDC-01；抑菌活性；抑菌机理；防治效果
中图分类号 S476+.19 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）13-0097-02
Research on Antibacterial Effect and Control Efficiency of Bacillus subterraneus ZDC-01
QIU Sen-sen 1 HU Xiu-jun 1 ZHU Feng-meng 1 ZHANG De-chao 2
（1 Qingdao Zhongda Agritech Co.，Ltd.，Qingdao Shandong 266109； 2 Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences）
Abstract The antimicrobial activity，antimicrobial mechanism and control effect of strain ZDC-01 isolated from the soil sediments of the seabed in the east China sea were studied.The results showed that the strain had significant inhibitory effect on 8 fungi，the inhibition rate of bacterial suspension was better than that of sterile filtrate，and the inhibition rate was 96.87%.By inoculation of spray-treated stab wound it was found that the control effects of fermentation broth and bacteria suspension decreased slightly with the prolongation of time，but were still equal to that of procymidone.The control effect of sterile filtrate was only 9.53% after 7 days.
Key words strain ZDC-01；antimicrobial activity；antimicrobial mechanism；control effect
植物病害是影响植物健康、作物产量甚至生态系统稳定性的一个重要因素，更是作物生产中不可忽视的一大难题。据统计，每年因植物病害造成的减产损失为总产量的10%～15%，其中70%～80%是由病原真菌侵染所致[1-2]。植物真菌病害不仅直接造成农作物产量下降、品质降低，而且部分病原真菌还分泌多种毒素，对农产品安全造成极大的威胁。此外，目前植物真菌病害的防治以化学防治为主，但化学药剂易造成农药残留、环境污染、抗药性等一系列问题，甚至会危害人畜健康。生物防治具有安全环保、持效期长等特点，其发展趋势与食品安全、生态环境和生物多样性有良好的相融性[3]。因此，寻找广谱、高效的生物农药成为农药发展的新方向。
随着生物防治研究的不断深入，从陆生资源中分离筛选出新的有效生防菌越来越难，探索新的生防资源迫在眉睫。海洋微生物因其遗传和代谢的特殊性而具有产生新型生物活性物质的巨大潜力[4-7]，目前已有关于海洋生防微生物的报道。邵彦坡等[8]发现了1株海洋放线菌B5对13种植物真菌病害有显著的抑制作用，并对其发酵液进行了稳定性测定；田 黎等[9]报道1株海洋芽孢杆菌B-9987的代谢产物不仅可以破坏真菌病害的菌丝，还可促进植物生长；陈 香等[10]鉴定了1株海洋短小枯草芽孢杆菌，并对其生长条件和抑菌活性进行了研究。本研究从东海海底土壤沉积物（北纬31°00′，东经124°3′）中分离筛选出1株具有抑菌活性的海洋细菌，在鉴定的基础上对该菌株的抑菌活性、抑菌机理以及室内防治效果进行了初步研究，以期为进一步研究该菌及其对植物病害的防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株。菌株ZDC-01，由中国科学院海洋研究所从东海海底土壤沉积物中分离获得，经形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将其鉴定为地下芽孢杆菌Bacillus subterraneus。供试病原真菌有苹果叶枯炭疽病菌（Glomerella cingulate）、茄子灰霉病菌（Botrytis cinerea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、柑橘炭疽病菌[Coll-etotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc]、苹果炭疽病菌（Glom-erella cingulata）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea），由青岛中达生物技术研究所生物實验室提供。
1.1.2 供试培养基。2216E培养基（酵母提取物1 g，蛋白胨5 g，琼脂粉20 g，过滤后的海水1 000 mL，pH调至7.4～7.5），用于海洋细菌菌株的活化与保存；LB培养基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.0～7.2），用于菌株ZDC-01的发酵培养和抑菌机理研究；PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.0～7.2），用于植物病原真菌的活化与保存。
1.1.3 供试药剂。50%腐霉利可湿性粉剂，由日本住友化学株式会社生产。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株ZDC-01抑菌活性测定。采用平板对峙培养法[11]，在直径90 mm的LB平板一侧接种病原菌菌饼，在平板另一侧划线接种菌株ZDC-01，两者相距25 mm，以单独接种病原菌的平板作对照。于25 ℃恒温暗培养，4 d后测量抑菌带宽度，每处理设3次重复。
1.2.2 菌株ZDC-01抑菌机理。用接种环挑取菌株ZDC-01的单菌落接种于LB液体培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下振荡培养48 h，得到菌株ZDC-01种子液。按2%的初始接种量接种于98 mL新鲜LB液体培养基中，按上述条件继续培养 48 h，即为ZDC-01发酵液。将发酵液于7 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，经细菌过滤器（孔径0.22 μm）过滤即得无菌滤液。将发酵液在7 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，收集菌体，用无菌水洗涤菌体，并用其制成菌悬液。
采用菌丝生长速率法[12]，将无菌滤液和菌悬液分别与融化冷却的LB培养基（45～50 ℃）混匀（稀释50倍），倒平板，于平板中央接种直径为5 mm的病原菌菌饼，以单独接种病原菌的平板作对照。于25 ℃恒温暗培养，待对照长满3/4培养皿时，用十字交叉法测量对照组及处理组的菌落直径，计算抑制率，每处理设3次重复。计算公式如下：
抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100
1.2.3 菌株ZDC-01对茄子灰霉病的防治效果。采用喷雾处理刺伤接种法[13]，选择长度240～300 mm的健康茄子，经流水洗净后用75%酒精表面消毒，晾干备用。在果实1/3、2/3处刺伤（伤口直径约0.3 mm，深约1.0 mm），每个果实4处伤口。将上述处理液均匀喷雾到果实上直到有水滴滴下，在无菌操作台上吹干后再次喷雾，直至每个果实接种15 mL处理液，于24 h后在刺伤处接种茄子灰霉病菌菌饼；对照组和农药处理组果实分别于喷雾15 mL无菌LB液体培养基和50%腐霉利可湿性粉剂2 500倍液后24 h在刺伤处接种茄子灰霉病菌菌饼。接种后果实置于25 ℃、100%相对湿度下培养，定期观察病斑扩展情况，测定病斑面积并计算防治效果。每个处理接种3个果实，设置3次重复。计算公式如下：
防治效果（%）=（对照组病斑面积-处理组病斑面积）/对照组病斑面积×100
2 结果与分析
2.1 菌株ZDC-01抑菌活性测定
通过对峙培养，对菌株ZDC-01的抑菌活性进行了测定，结果见表1。可以看出，菌株ZDC-01对苹果叶枯炭疽病菌、茄子灰霉病菌、白菜黑斑病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、苹果炭疽病菌、苹果轮纹病菌8株病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌带宽度在17.8～23.2 mm之间。其中，对茄子灰霉病菌的抑菌活性最高，其抑菌带宽度为23.2 mm；其次是苹果叶枯炭疽病菌和棉花枯萎病菌，抑菌带宽度分别为22.7、21.8 mm；对柑橘炭疽病菌的抑菌作用最差，抑菌带宽度为17.8 mm。
2.2 菌株ZDC-01的抑菌机理
由表2可知，菌株ZDC-01无菌滤液、菌悬液对8种病原菌的抑制率存在显著差异。菌悬液对8种病原菌的抑制率在88.35%～96.87%之间，而无菌滤液对病原菌的抑制率在0.35%～13.73%之间，无菌滤液处理的抑制率均显著低于菌悬液处理的抑制率。菌悬液对茄子灰霉病菌的抑制率最高，达96.87%；其后是苹果叶枯炭疽病菌和小麦赤霉病菌，抑制率分别为94.89%、94.53%；对柑橘炭疽病菌的抑制率最低，为88.35%。
2.3 菌株ZDC-01对茄子灰霉病的防治效果
由图1可知，菌株ZDC-01发酵液、无菌滤液和菌悬液对茄子灰霉病均有一定的防治效果，菌株ZDC-01发酵液和菌悬液处理的防治效果与腐霉利处理的防治效果不存在显著差异（P<0.05）；但无菌滤液的处理防效较差，7 d后防效仅为9.53%。喷施菌株ZDC-01发酵液和菌悬液后，防治效果随时间的延长有所降低，从接种3 d后的92.57%、93.12%下降至7 d后的90.37%、89.76%，但仍与腐霉利处理效果相当。
3 讨论
本研究表明，地下芽孢杆菌Bacillus subterraneus抗菌谱广、拮抗活性高；在抑菌机理的试验中发现，菌悬液主要起抑菌作用，抑菌率高达96.87%；室内试验中，喷施发酵液、菌悬液的防效与腐霉利处理无显著差异，而无菌滤液的防效较差，推测在抑菌过程中菌株活体起主导作用，而代谢产物的作用甚微。由于室内与田间环境差异很大，对其能否应用于生产实践还需做进一步的田间试验验证。另外，其发酵条件、运输及储存方式等也需要深入研究。
目前，报道的芽孢杆菌主要是从陆地土壤中筛选得到，很少来自海洋[14-17]。由于海洋环境的极特殊性，如高压、高盐、低营养、低温、无光照等特点都决定了生活于其中的微生物具有不同于陆地微生物的特点，使其代谢方式具有特异性，而产生结构和功能独特的天然活性代谢产物，具有重要的開发价值。因此，利用海洋微生物寻找新的药物资源成为研究热点[18]。
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