天门冬的体外抑菌作用
摘要：利用水煎法、醇提取法和超声波提取法制备天门冬（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｌｏｕｒ） Ｍｅｒｒ．）提取液，并通过正交试验对超声波提取工艺进行优化；采用杯碟法测定天门冬提取液的抑菌圈直径；采用液体稀释法测定最低抑菌浓度。结果表明，超声波提取所用条件为７０％的乙醇、浸泡时间６ ｈ、提取时间２０ ｍｉｎ和提取温度３５ ℃时，所得天门冬提取液对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）抑制作用最强，对这３种菌的最低抑菌浓度分别为３．１３、６．２５和１２．５０ ｍｇ／ｍＬ。说明天门冬提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉有较强的抑制作用，是一种天然抑菌剂。
关键词：天门冬（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｌｏｕｒ） Ｍｅｒｒ．）；提取工艺；抑菌作用
中图分类号：Ｑ９４６．８８７；Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－0931-03
In vitro Antimicrobial Test of Asparagus cochinchinensis （Lour） Merr.
ＦＡＮＧ Ｆａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｈｅｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙｕ－ｐｉｎｇ，ＬＩ Ｗｅｎ－ｂｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｌｅｉ，ＬＩ Ｄｏｎｇ－ｙａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈｕａｉｙｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｉ＇ａｎ ２２３００３， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ （ｗａｔｅｒ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ， ａｌｃｏｈｏｌ ｒｅｆｌｕｘ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ） ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ the ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃting ｆｏｒ ２０ ｍｉｎ ａｔ ３５ ℃ ｗｉｔｈ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｆｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｎｇ ６ ｈ． Under ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｔｈｅ ＭＩＣ ｗａｓ ３．１３ ｍｇ／ｍＬ）， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （ｔｈｅ ＭＩＣ ｗａｓ ６．２５ ｍｇ／ｍＬ） ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ｔｈｅ ＭＩＣ ｗａｓ １２．５０ ｍｇ／ｍＬ）． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ against Ｓ. ａｕｒｅｕｓ， Ｅ. ｃｏｌｉ ａｎｄ Ａ. ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｉｔ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ） Ｍｅｒｒ； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ
天门冬（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ）Ｍｅｒｒ）为百合科天门冬属的一种，其干燥块根可以入药［１］，有养阴清热、润燥生津之功效［２］。目前，关于天门冬的研究主要集中于化学成分、药理、栽培和野生资源开发等方面。对其抑菌能力的研究不多。已有的文献显示，天门冬提取液对炭疽杆菌２０６、甲型及乙型溶血性链球菌、白喉杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、类白喉杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌及枯草杆菌均有不同程度的抑制作用［３，４］。可见，天门冬具备一定的抑菌能力，有望将其提取液加入到香皂或洗手液等洗化用品中，制成抑菌洗化用品。目前市面上知名的抑菌洗化用品多是利用三氯卡班、对氯间二甲苯酚、ＤＭＤＭ乙内酰脲等化学物质抑菌，而如能利用天门冬这种药食同源的植物制成提取液来抑菌，则更为健康安全。另据《月华于本草》记载，天门冬能“镇心，润五脏，益皮肤，悦颜色”；《本草纲目》记载，天门冬与蜂蜜一起混合捣成液状搀入洗脸水，连续用一个月皮肤即变白嫩。因此将天门冬提取物加入到洗化用品中，洗化用品的品质则可大幅度提升，可同时达到抑菌、护肤和美白的功效。本研究主要利用３种方法（水煎法、醇提取法和超声波提取法）制备天门冬提取液，考察不同提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑曲霉的抑菌效果，旨在为制备天门冬抑菌洗化用品提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料
天门冬块根购于淮安药房，产地为贵州。
１．２ 仪器、试剂与菌种
ＦＷ８０型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ＨＨ－４数显恒温水浴锅（江苏省金坛市晶玻实验仪器厂）；ＤＳＸ－２８０Ｂ不锈钢手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）；ＢＣＭ－１０００超净工作台（苏州净化设备有限公司）；ＤＨ３６００电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；超声波清洗器、旋转蒸发器、电炉、分析天平、１０．０ ｍｍ×７．８ ｍｍ×（６．０±０．１） ｍｍ牛津杯和其他实验室常用玻璃仪器。
牛肉浸膏，蛋白胨，氯化钠、琼脂、乙醇、石油醚、葡萄糖等均为分析纯。
供试菌株３种：金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ），大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养，黑曲霉采用马铃薯葡萄糖培养基培养。
１．３ 方法
１．３．１ 天门冬提取液制备方法
１）水煎法［５］。称取天门冬块根１００ ｇ，冷水浸泡２０～３０ ｍｉｎ，分２次加水煎煮：第一次加水６００ ｍＬ，第二次加水４００ ｍＬ，均待水烧开后改用文火煮３０ ｍｉｎ，用４层纱布过滤；合并２次滤液，除去药渣，水浴加热浓缩至１００ ｍＬ，即得到浓度为１ ｇ／ｍＬ的天门冬提取液。经高压蒸气灭菌后备用。
２）醇提取法［６，７］。称取天门冬块根粉末２０ ｇ ２份，并用纱布包裹，各自放入索氏提取器内，为了保持固液比为１∶１０，在圆形瓶中分别加入２００ ｍＬ ５０％乙醇和９０％乙醇，接好装置后，两组各自回流２ ｈ。回流结束后，将回流液体用旋转蒸发器浓缩至含生药１ ｇ／ｍＬ，过滤灭菌后保存备用。
３）超声波提取法［８］。采用４００ Ｗ的功率对天门冬块根粉末进行超声提取。提取过程中，对提取效果影响较大的因素主要有浸泡时间、提取温度、提取时间、有机溶剂、固液比等，其中固液比以１∶１０～１５为宜。因此本试验固定固液比为１∶１０，以浸泡时间、提取温度、提取时间、有机溶剂为变化因素，超声提取结束后，将提取液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ， 各提取滤液用旋转蒸发器浓缩至含生药１ ｇ／ｍＬ，过滤灭菌，以天门冬提取液抑菌效果为评价指标，通过Ｌ９（３４）正交试验（表１）考察天门冬抑菌物质的最佳提取工艺。
１．３．２ 天门冬提取液抑菌活性测定 采用杯碟法测定提取液抑菌活性。取浓度为２．０×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ的各种待测菌悬液０．１ ｍＬ，涂布在相应凝固培养基平板上，之后将每个平板放入２个灭菌牛津杯，其中１个为平行，１个为对照（水煎法以无菌水为对照；醇提取法以同一浸提含量的乙醇为对照；超声波提取法以浸提用有机溶剂为对照）。分别用移液枪取不同提取方法所得的天门冬提取液加入牛津杯中，细菌３７ ℃、黑曲霉２８ ℃培养２４ ｈ后，移去牛津杯，测定抑菌圈直径，每组平行３次，取其平均值。
为了更准确地反映天门冬块根中所含物质的抑菌效果，而非有机溶剂对菌株的抑制作用，故定义本文中抑菌圈直径＝试验组抑菌圈直径－对照组抑菌圈直径。
１．３．３ 天门冬提取液最小抑菌浓度（ＭＩＣ）测量 在小试管中先加入牛肉膏蛋白胨液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基１．６ ｍＬ，再加入０．２ ｍＬ ２．０×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ测试菌液，最后加入倍比稀释的天门冬提取液（用上面试验得到抑菌效果最佳的提取方法制备，将原液浓度视为１００％）０．２ ｍＬ，混匀，以无菌水作为空白对照。每个浓度做３ 个平行，细菌于３７ ℃培养箱中培养２４ ｈ。黑曲霉于２８ ℃培养４８ ｈ。肉眼观察试管浊度，以不显示浊度的最低药液浓度作为ＭＩＣ［９，１０］。
２ 结果与分析
２．１ 水煎法所得天门冬提取液的抑菌效果
从抑菌试验结果（表２）可以看出，水煎法所得天门冬提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑曲霉都有较强的抑制作用，而且对细菌的抑制作用略强于对真菌的抑制作用。
２．２ 醇提取法所得提取液的抑菌效果
试验结果（表３）表明，用９０％的乙醇所得的天门冬提取液对金黄色葡萄球菌、黑曲霉的抑菌效果比５０％的乙醇好，但对大肠杆菌的抑菌效果比５０％的乙醇略差。但醇提取法相对于水煎法来说，效果明显要好。
２．３ 超声波提取法所得提取液的抑菌效果
正交试验结果（表４）表明，有机溶剂对于抑菌效果的影响最为显著，其次是浸泡时间、提取时间。浸泡时间和提取时间需适中，过长可能会破坏天门冬提取液中有效抑菌物质，过短又可能不利于有效抑菌物质的浸出。提取温度对试验影响不很显著，可能因为选取的３个温度相差不大，没有过高或过低的温度。通过综合评分，得出超声波提取法的最优方案为Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ１，即浸泡时间６ ｈ，提取时间２０ ｍｉｎ，提取温度３５ ℃，有机溶剂选用７０％的乙醇。但是优化方案并没有出现在９组试验中，为了证实理论分析，进行了补充验证试验。在此优化方案下进行提取，提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑曲霉抑菌圈直径（减去对照后）分别为２５．７、２２．７、２１．７ ｍｍ，都大于其他试验组，表明优化方案成立。
２．４ 天门冬提取液最小抑菌浓度（ＭＩＣ）
用上述优化方案（浸泡时间６ ｈ，提取时间２０ ｍｉｎ，提取温度３５ ℃，有机溶剂选用７０％的乙醇）提取天门冬块根，所得提取液分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑曲霉进行最小抑菌浓度测定，结果如表５所示。天门冬提取液对金黄色葡萄球菌的ＭＩＣ为３．１３ ｍｇ／ｍＬ；对大肠杆菌的ＭＩＣ为６．２５ ｍｇ／ｍＬ；对黑曲霉的ＭＩＣ为１２．５０ ｍｇ／ｍＬ。因此，天门冬提取液对３种菌的抑制效果依次为：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉。
３ 讨论
目前，中药的提取方法有水煎法、醇提取法、微波提取法、超声波法、超临界ＣＯ２流体萃取法等［11］。本试验利用水煎法、醇提取法和超声波提取法制备天门冬提取液，考察不同提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑曲霉的抑菌效果。结果显示，在浸泡时间６ ｈ，提取时间２０ ｍｉｎ，提取温度３５ ℃，有机溶剂选用７０％乙醇的条件下所得提取液的抑菌效果最好。从试验操作和抑菌效果两方面综合评价３种方法，则超声波提取法最好，醇提取法次之，水煎法效果最差，因为超声波提取法操作简便，便于优化，效果好，而醇提取法和水煎法易受人为操作影响，如温度和火候控制不好，对试验结果会造成很大的影响。另外醇提取法和水煎法所用温度较高，有可能破坏天门冬提取液中的抑菌物质。
此外，在超声波提取法中，有机溶剂对抑菌效果的影响最显著，提取效果为７０％乙醇最好，９０％乙醇次之，石油醚较差，由此可见天门冬块根中的抑菌有效成分多能溶于极性较大的有机溶剂中，而溶于石油醚等极性较小的有机溶剂中的成分较少。综合醇提取法和超声波提取法的结果可以看出，不同浓度的乙醇所得提取液的抑菌效果也有差别。
天门冬块根中含天冬酰胺及谷氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸等１９种氨基酸，还含有β－谷甾醇、甾体皂苷、黏液质、寡糖、多糖、糠醛衍生物等成分［１］。根据所用有机溶剂的提取效果，天门冬块根中抑菌成分可能为氨基酸、多糖、β－谷甾醇、甾体皂苷等物质。虽然天门冬有效抑菌物质的具体成分尚不清楚，其分离纯化有待进一步研究，但是天门冬抑菌成分的提取方法操作步骤简单、溶剂消耗量少、提取时间短、抑菌效果好、生产成本低，开发生产天门冬抑菌洗化用品将会逐步走向产业化。
参考文献：
［１］ 赵 明．我国天门冬研究的概况及展望［Ｊ］．内江师范学院学报，２００５（６）：５２－５５．
［２］ 欧立军，叶 威，白 成，等．天门冬药理与临床应用研究进展［Ｊ］． 怀化学院学报，２０１０，２９（２）：６９－７１．
［３］ 国家中医药管理局，中华本草编委会．中华本草［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９９９．６４．
［４］ ＭＡＮＤＡＬ Ｓ Ｃ，ＮＡＮＤＹ Ａ，ＰＡＬ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ ｒｏｏｔ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ Ｒｅｓ，２０００，１４（２）：ｌ１８－１１９．
［５］ 马廉兰，曹祥凤． １１４种中草药对伤寒和痢疾杆菌的抑菌实验［Ｊ］．疾病控制杂志，２０００，４（２）：１７８．
［６］ 康 旭，李冬生，邓 川，等．金银花提取液抑菌活性的研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２０１０，３８（２７）：１４９３５－１４９３６．
［７］ 徐固华，夏新奎，刘永垒．灰灰菜抑菌成分提取及其抑菌活性研究［Ｊ］． 湖北农业科学，２０１０，４９（１１）：２８０２－２８０６．
［８］ 刘晶瑜，薛广厚，望秀玲，等．十种药用植物超声提取物及其抑菌作用研究［Ｊ］．湖北农业科学，２０１１，５０（９）：１８０９－１８１１．
［９］ 徐叔云，卞如濂，陈 修．药理实验方法学［Ｍ］．第三版．北京：人民卫生出版社，２００３．１６５０－１６５９．
［１０］ 陈国胜． ５种中草药抑菌作用的研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２００８，３６（１４）：５９４０－５９４１．
［１１］ 肖淑娟，于守武．现代中药提取分离新技术［Ｊ］．河北理工大学学报（自然科学版），２０１０，３２（２）：８４－８６．