超声波辅助酶法提取林蛙皮生物活性肽抑菌活性的研究
摘 要：以东北林蛙皮为原料，采用超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法提取林蛙皮生物活性肽，通过对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌圈试验确定提取物对各测试菌株的抑菌效果，最后确定最小抑菌浓度。由此可见，超声波辅助酶解法是提取林蛙皮生物活性肽的一种有效提取方法。
关键词：林蛙皮;生物活性肽;抑菌性
中图分类号：Q814.4 文献标识码：A
林蛙是我国重要的经济蛙类，在我国分布广泛，主要集中于东北各林区，尤其是长白山、小兴安岭一带。林蛙皮肤湿润、裸露，为抵御环境有害因子侵袭，其皮肤分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性肽[1]，含量可达10%以上[2]。生物活性肽通常是指由几个或几十个氨基酸分子形成的小肽。小肽是蛋白质分解的中间产物，研究表明，小肽和游离氨基酸一样可进入肠黏膜细胞，不仅可在小肠内被直接吸收，并且具有多种生理功能。酶解法可以生产大量的小肽并且成本较低。本研究首次采用Alcalase蛋白酶提取林蛙皮中的抗菌多肽，并进行体外抗菌作用研究，为进一步探讨其抗菌作用机理，将其开发为高效药用资源，机体营养物质吸收，食物保鲜剂改善食品硬度及口味等方面提供参考[3-5]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
林蛙为长白山林蛙，购自吉林市市场;大肠杆菌、四联球菌、金黄色葡萄球菌菌种均由吉林农业科技学院微生物实验室提供;Alcalase蛋白酶试剂，由诺维信公司生产;氨苄青霉素、95%乙醇、甲醇、牛肉膏、蛋白胨、琼脂由鼎国生物技术有限责任公司生产。
HZQ-F160A型恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;DHG-9240A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 林蛙皮生物活性肽的提取
取蒸馏水清洗林蛙，用纱布吸干皮肤水分，剥取林蛙皮肤与肉质分离，用10% Na2CO3溶液清洗蛙皮，去除色素等可溶性杂质，以清水洗涤至pH为8.0。放入40℃烘箱内烘干至恒重，适度粉碎过160目筛，此为预处理后的样品。称取2g林蛙皮粉末，加入30ML pH8.0的Tris-HCl缓冲液。用超声波细胞破碎机进行破碎（功率400w、超声次数200次，超声3s停3s），破碎完毕后，经超声波提取器（功率44w，温度25℃）处理25min，加入1.5gAlcalase 蛋白酶在40℃水浴锅中酶解4h，将提取液以8000r/min离心20min，取上清液冷冻干燥后回溶于Tris-HCl缓冲液备用。
1.2.2 超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法的抑菌效果
取37℃恒温培养2d活化菌种，转移至液体培养基，37℃培养12h。无菌条件下，吸取1mL菌悬液用生理盐水分别稀释10倍、20倍、30倍、40倍、50倍，用显微镜计数法分别对各菌悬液计数，选取含菌量约为106cfu/mL～107cfu/mL的菌悬液备用。
制作双层培养基做抑菌圈，将5mL左右的LB固体培养基倒入培养皿中，待培养基凝固后，分别倒入混有3种菌种稀释液的培养基铺平板。待培养基凝固后用打洞法在平板上层打出直径10mm圆洞，分别加入阴性对照，阳性对照（50mg/mLAmp），生物活性肽，正置于37℃培养箱中培养1d，以测定抑菌圈直径大小作为依据衡量对3种细菌的抑制能力。
1.2.3 林蛙皮生物活性肽最小抑菌浓度的测定
林蛙皮生物活性肽的最小抑菌浓度采用微量稀释法测定。向微量酶标反应板各孔中分别加入50μL生物活性肽溶液，设置生长对照孔和培养基空白对照孔，每孔再加入106～107cfu/mL细菌悬液，然后放置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
2 结果与分析
2.1 超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法的抑菌效果
林蛙皮生物活性肽对不同微生物的抑菌效果见表1。
如表1所示，超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法所得提取物对革兰氏阳性菌抑菌效果显著，对革兰氏阴性菌也有一定的抑菌效果，说明Alcalase蛋白酶酶解法提取林蛙皮生物活性肽可行，提取物的抑菌效果显著，含量高，稳定性好，与传统甲醇提取法相比避免使用甲醇溶液。
2.2 林蛙皮生物活性肽最小抑菌浓度的测定
林蛙皮生物活性肽对各供试菌株的最小抑菌浓度为：金黄色葡萄球菌为0.25mg/mL，四链球菌为0.5mg/mL，大肠杆菌为0.75mg/mL。
3 结论
采用超声波辅助Alcalase蛋白酶酶解法提取林蛙皮生物活性肽，通过对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌圈试验确定提取物对各测试菌株的抑菌效果，最后确定最小抑菌浓度。由此可见，超声波辅助酶解法是提取林蛙皮生物活性肽的一种有效方法。此提取方法的确定为大量提取林蛙皮生物活性肽提供了新思路。
参考文献
[1] 徐佳佳，肖向红，柴龙会，等.大肠杆菌胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽分泌特性研究[J].经济动物学报，2010，14（02）：103-106.
[2] 巢警殳.林蛙皮活性肤对小鼠免疫功能的影响[D].吉林大学，2011.
[3] 袁德云，王立梅，胡耀辉.林蛙皮抗菌肽的提取及其某些特性的测定[J].吉林农业大学学报，2001，23（02）：113-116.
[4] 雷萍，金宗镰.几种食物源性生物活性肽[J].食品研究与开发，2004，25（6）： 132-134.
[5] 陈贵堂，赵霖.食物源生物活性肽及其营养生理价值[J].中国临床营养杂志，2005，13（5）：312-315.
作者简介：杨闯（1984-），男，汉族，助教，硕士研究生，主要从事食品生物技术方向研究。