2种提取工艺对橄榄果实多酚含量及抗氧化活性的影响
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1.1 材料、试剂与仪器
橄榄：‘长营’品种，于2015年11月20日采自福建省闽清县梅溪镇白石坑村久源橄榄专业合作社（26°14′55″N，118°51′57″E），选择成熟一致、无机械损伤、无病虫害、大小均一的完全成熟果实，所采样品装入4 ℃采样箱，立即带回实验室，用自来水冲洗干净，过蒸馏水，晾干后用小刀手工取核，然后用液氮快速冷冻，在真空冷冻干燥机下冻干，粉碎，过40目筛，-40 ℃保存待用。
试剂：没食子酸标准品（GA）（HPLC纯≥98%），Folin-Ciocalteu试剂（分析纯），trolox[（±）-6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]，TPTZ（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine），Sigma-Aldrich 公司；无水碳酸钠，乙醇均为分析纯。
仪器：Lambda 35紫外/可见光光谱仪，PerkinElmer Corporation；真空冷冻干燥机，Thermo HetoPowerDry LL1500冻干机（Thermo Electron Corporation）；SHA-BA水浴恒温振荡器，常州朗越仪器制造有限公司；TGL-16G 台式离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 有机溶剂提取工艺的正交实验设计 分别称取1 g冻干橄榄果实粉末，置于100 mL三角瓶内，加入40 mL 60%乙醇水溶液，用瓶塞盖上三角瓶口，用水浴震荡器浸提，提取1次，4 000 r/min离心5 min，定容，进行测定。固定其它条件，分别考察乙醇浓度、提取温度、液料比、提取时间对橄榄果实多酚含量的影响。确定较佳的单因素实验条件范围，在此基础上，以料液比、温度、时间、乙醇浓度为主要影响因素，每个因素设3个水平，安排四因素三水平的L9（34）正交试验，因素与水平见表1。
1.2.2 超声波提取工艺的正交实验设计 分别称取1 g冻干橄榄果实粉末，置于100 mL离心管内，加入20 mL 60%乙醇水溶液，用一次性薄膜封口，用超声波细胞破碎仪浸提，提取1 次，4 000 r/min离心5 min，定容，进行测定。分别考察液料比、提取时间、提取功率、乙醇浓度对橄榄果实多酚含量的影响，确定最佳单因素实验条件范围，在此基础上，以液料比、提取时间、提取功率、乙醇浓度为主要影响因素，各选出3 个水平，安排四因素三水平L9（34）进行试验，因素与水平见表2。
1.2.3 多酚含量（TP）测定 采用Folin-Ciocalteu比色法[4]并作适当修改。所有提取液加双蒸水稀释，使得其可读取范围在标准曲线0.0～120 μg GA/mL范围内。在15 mL塑料离心管中，加入1 mL没食子酸溶液，然后加入1 mL Folin-Ciocalteu试剂，充分混匀，室温下静置3 min，加1.5 mL 10% Na2CO3溶液。加双蒸水使终体积为10 mL，充分混匀反应液，30 ℃下避光放置120 min后，于波长765 nm吸光度下用紫外分光光度计进行测定。没食子酸作为标准曲线，总多酚提取量以每g干质量等同于没食子酸的毫克数表示（mg/g）。重复3次取平均值。
1.2.4 抗氧化能力 采用铁离子还原能力（Ferric reducing ability of power，FRAP）法测定[23]。简言之，准确吸取样品溶液50 μL，加入3 mL TPTZ工作液，37 ℃下有机溶剂30 min，测定593 nm处的吸光度。Trolox作为标准曲线，样品中FRAP值以每g干重相当Trolox的微摩尔数表示（μmol/g）。重复3次取平均值。
1.3 数据处理
每组实验平行3次，数据均以平均值表示，方差分析均采用SPSS18.0 for windows软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 有机溶剂提取正交实验结果
有机溶剂提取按表1因素与水平试验，实验结果见表3，结果分析见表4、5、6和图1。由表4 极差分析结果可知，各因素对多酚提取量和总还原力FRAP的影响程度依次为：D>B>C>A，即乙醇浓度>提取时间>提取温度>料液比。这说明乙醇浓度对橄榄多酚提取量和FRAP的影响最大。结合多酚和FRAP 2个指标值，确定优化组合为A2B3C3D1，即在料液比1 ∶ 60、提取时间90 min、提取温度60 ℃及50%乙醇浓度下，多酚提取量和总还原力FRAP最高。
正交试验结果方差分析见表5、6及图1。除因素A对多酚提取量的不显著外，B、C及D的显著性水平均小于0.05；可见，除料液比外，提取温度、提取时间及乙醇浓度均对橄榄多酚提取量和FRAP有显著影响。结合R值可见，乙醇浓度是有机溶剂提取的关键因素。如图1所示，综合各因素对多酚提取量和FRAP的影响，以A2B3C3D1为最优试验组合，与极差分析结果相同。而从表3中9组试验组合可见，提高多酚提取量和保持生物活性的最佳工艺组合为A2B2C3D1，2种组合间只有时间不同，考虑到本实验主要是研究提取工艺对橄榄生物活性的保持能力，因此选择时间较短的组合A2B2C3D1。
由于有机溶剂提取工艺最佳理论组合不在于9个处理中，需追加验证实验。精确称取橄榄干粉1 g，在料液比1 ∶ 60、提取时间90 min、有机溶剂温度60 ℃、50%乙醇的最佳提取条件下，进行验证实验，橄榄多酚提取量和FRAP分别为（79.83± 0.23）mg/g和（720.34±16.85）μmol/g（n=3），多酚提取量略高于正交试验结果（79.07 mg/g），而FRAP略低于正交试验结果（740.45 μmol/g），这可能是由于提取时间过长，持续温度过高导致橄榄多酚总还原能力降低。因此综合对多酚提取量和总还原力的影响，可采用正交试验表中组合A2B2C3D1，即料液比1 ∶ 60、提取时间60 min、提取温度60 ℃以及50%乙醇为最佳提取工艺条件。
2.2 超声波提取正交实验结果
超声波提取按表2因素与水平试验，实验结果见表7，结果分析见表8、9、10和图2。由表9极差分析结果可知，各因素对多酚提取量和总还原力FRAP的影响程度分别为A>B>D>C和A>C>B>D。这说明A料液比对橄榄多酚提取量和FRAP的影响最大。结合多酚和FRAP 2个指标值，确定优化组合为A3B1C3D2，即在料液比1 ∶ 40、提取时间20 min、超声功率180 W及60%乙醇浓度下，多酚提取量和总还原力FRAP均为最高。
正交试验结果方差分析见表10、11及图2。四个因素对多酚提取量和总还原力FRAP均表现为显著水平。可见，料液比、提取时间、超声功率及乙醇浓度均对橄榄多酚提取量和FRAP有显著影响。结合R值可见，料液比是超声波提取的关键因素。如图2所示，结合各因素对多酚提取量和FRAP的影响，以A3B1C3D2为最优试验组合，该组合与极差分析结果相同。
对多酚提取量和总还原力FRAP的综合分析得出，超声波提取工艺最佳理论组合为A3B1C3D2。即料液比1 ∶ 40、提取时间20 min、超声功率180 W及60%乙醇。该组合出现在9组试验的第7组合中，因此确定最终组合为A3B1C3D2为最佳提取工艺条件。
2.3 有机溶剂提取与超声波提取的比较
分别采用有机溶剂提取和超声波提取橄榄果实中多酚以对总还原力FRAP的影响，结果显示，超声波提取法最佳工艺提取多酚含量为85.26 mg/g，FRAP为952.27 μmol/g，有机溶剂提取法多酚含量为79.07 mg/g，FRAP为740.45 μmol/g。相比有机溶剂提取，超声波提取法的多酚提取量和总还原力FRAP分别提高了6.19 mg/g和211.82 μmol/g，可见超声波提取优于有机溶剂提取工艺。
3 讨论与结论
常见的植物多酚提取有溶剂浸提、超声波提取、微波提取等方法[24]。有机溶剂浸提是根据植物多酚与提取溶剂的溶解性差异进行提取[25]。对山核桃仁[26]、香蕉皮[27]、茶树菇[28]总多酚提取工艺进行优化，得出不同的提取工艺条件，这可能是由于不同材料中多酚类物质的化学结构受到不同溶剂极性、温度、溶剂量等因素的影响水平所致[29]。本研究对有机溶剂提取工艺优化表明，在料液比1 ∶ 60、提取时间60 min、提取温度60 ℃、50%乙醇浓度条件下，橄榄多酚提取量和总还原力FRAP为79.07 mg/g和740.45 μmol/g。而林玉芳等[20]研究表明在最优提取工艺条件下，橄榄多酚的提取得率为32.13%，提取率高于本研究结果，这是因为两者对多酚含量采用不同的测试方法造成多酚提取量的不同。
超声波提取是利用超声波产生的空化效应，形成共振腔，使细胞膨胀以及细胞壁破碎，有效成分高效溶出[30]。利用该方法优化提取植物多酚已有大量报道。冯子旺[31]等优化得到桑黄多酚提取工艺为乙醇浓度60%，超声时间30 min，超声温度50 ℃，料液比1 ∶ 25，该条件下其总多酚提取率可达26.4 mg/g。郑利琴等[32]对杨梅汁多酚的提取工艺进行研究表明乙醇体积分数为60%，超声波功率500 W，处理时间35 min，料液比为1 ∶ 4，多酚提取量为609.256 mg/L。橄榄超声波提取法的优化工艺为料液比1 ∶ 40、提取时间20 min、超声功率180 W、乙醇浓度60%，该条件下多酚提取量为85.26 mg/g，总还原力FRAP为952.27 μmol/g。这与上述研究结果略有不同，可能是不同植物材料中总多酚极性及其组成成分需要不同的提取条件。
对2种提取方法比较显示，超声波提取具有提取时间短（20 min）、溶剂用量少（1 ∶ 40）、多酚提取量大（85.26 mg/g）、总还原力强（952.27 μmol/g）的优点。表明超声波提取橄榄果实多酚具有提取速度快，溶剂用量少，能有效避免因时间持续长，温度积累过高导致有效成分损失以及抗氧化能力降低，处理简单等优点，所以从节约成本，实际生产角度考虑，超声波提取是一种较好的工艺方法。
通过正交优化，本研究确定了橄榄果实多酚提取的最优有机溶剂条件为料液比1 ∶ 60、提取时间60 min、提取温度60 ℃、50%乙醇浓度。在此条件下，橄榄多酚提取量和总还原力FRAP为79.07 mg/g和740.45 μmol/g。超声波提取法的最优条件为料液比1 ∶ 40、提取时间20 min、超声功率180 W及60%乙醇。在此条件下，橄榄多酚提取量为85.26 mg/g，总还原力FRAP为952.27 μmol/g。超声波提取对多酚提取量和抗氧化能力明显优于有机溶剂提取，因此超声波提取是一种较为理想的提取橄榄果实多酚的方法。
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